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突变型dna聚合酶及相关方法
专利名称:突变型dna聚合酶及相关方法
技术领域:
本发明涉及DNA聚合酶领域及它们的各种应用,包括核酸的
引物延伸与扩增。
背景技术:
DNA聚合酶负责基因组的复制和维护,这是在世代间精确传
递遗传信息的中心职责。DNA聚合酶在细胞中的功能是作为
负责DNA合成的酶。它们在有金属活化剂诸如Mg2+存在的
情况下,以被复制的DNA模板或多核苷酸模板支配的顺序聚
合脱氧核糖核苷三磷酸。在体内,DNA聚合酶参与一系列DNA
合成过程,包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在
每一DNA合成过程期间,复制DNA模板一次或最多几次产生
一致的复制品。与此相反,在体外,DNA复制可以重复多次,
例如在聚合酶链式反应期间(参见例如Mullis的美国专利
号4,683,202)。在聚合酶链式反应(PCR)的最初研究中,DNA
聚合酶是在DNA复制的每一循环开始时添加(参见上述美国
专利号4,683,20。后来,确认了从在高温下生长的细菌
中可获得热稳定DNA聚合酶,这些酶只需要添加一次(参见
Gelfand的美国专利号4,889,818和Mullis的美国专利号
4,965,188)。在PCR期间使用的高温下,这些酶没有不可
逆失活。因此,可以进行聚合酶链式反应的重复循环而不需
要在每一合成加成过程开始时添加新鲜的酶。DNA聚合酶特
别是热稳定聚合酶,是重组DNA研究和疾病的医疗诊断中大
量技术的关键。特别是对于诊断应用,靶核酸序列可能仅仅
是所考察(inquestion)DNA或RNA的一小部分,因此不扩
增的话可能难以检测到靶核酸序列的存在。聚合酶的总体折
叠模式类似人的右手,包括手掌、手指和拇指三个独特的亚
结构域。(参见Beese等,Science
260:352-355,1993);Patel等,BioChemistry34
5351-5363,1995)。尽管在大小和细胞功能不同的聚合酶之
间手指和拇指亚结构域的结构变化很大,但催化性的手掌亚
结构域全部都是重叠的(superimposable)。例如,与引入
的dNTP相互作用并在化学催化作用期间稳定过渡态的基序
A是重叠的,在哺乳动物ροα和原核生物的polI家族
DNA聚合酶之间的平均偏差大约为1人(Wang等,Cell89
1087-1099,1997)。在结构上基序A以主要包括疏水性残基
的反向平行β链起始,延续到α-螺旋。DNA聚合酶活性位
点的主要氨基酸序列是特别保守的。基序A的例子中,例
如,序列DYSQIELR(SEQIDNO:30)保留在从数百万年进化的
生物体包括例如水生栖热菌(Thermusaquaticus)、沙目艮
衣原体(Chlamydiatrachomatis)禾口大肠杆菌
(Escherichiacoli)分离的聚合酶中。把这些观察结果联系
在一起,它们指出聚合酶通过类似的催化机理行使功能。除
了高度保守之外,DNA聚合酶的活性位点也被证明是相对易
变的,能够接受特定的氨基酸取代而不显著降低DNA聚合酶
活性。(参见例如I^atel等的美国专利号6,602,695)。这
样的突变型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反应的诊断
和研究应用中提供各种选择优势。本发明,如同在此阐述的,
满足这些及其它需要。发明概述本发明提供了相对于相应的
未经修饰的聚合酶具有改良的酶活性的DNA聚合酶,它可以
用于多种核酸合成应用中。在一些实施方式中,聚合酶是分
离的或纯化的。在一些实施方式中,DNA聚合酶包含氨基
酸序列
A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8-X9-Xltl-X11-L-X
12-X13-X14-X15(SEQIDN0:1),其中X2,X5,X6,X9,和
Xltl是任何氨基酸,amp;是!^或0,是N或H,)(4是1^
或I,X7是D,K或T,)(8是1^或V,X11是
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