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突变型dna聚合酶及相关方法

专利名称：突变型dna聚合酶及相关方法

技术领域：

本发明涉及DNA聚合酶领域及它们的各种应用，包括核酸的

引物延伸与扩增。

背景技术：

DNA聚合酶负责基因组的复制和维护，这是在世代间精确传

递遗传信息的中心职责。DNA聚合酶在细胞中的功能是作为

负责DNA合成的酶。它们在有金属活化剂诸如Mg2+存在的

情况下，以被复制的DNA模板或多核苷酸模板支配的顺序聚

合脱氧核糖核苷三磷酸。在体内，DNA聚合酶参与一系列DNA

合成过程，包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在

每一DNA合成过程期间，复制DNA模板一次或最多几次产生

一致的复制品。与此相反，在体外，DNA复制可以重复多次，

例如在聚合酶链式反应期间(参见例如Mullis的美国专利

号4，683，202)。在聚合酶链式反应(PCR)的最初研究中，DNA

聚合酶是在DNA复制的每一循环开始时添加(参见上述美国

专利号4，683，20。后来，确认了从在高温下生长的细菌

中可获得热稳定DNA聚合酶，这些酶只需要添加一次(参见

Gelfand的美国专利号4，889，818和Mullis的美国专利号

4，965，188)。在PCR期间使用的高温下，这些酶没有不可

逆失活。因此，可以进行聚合酶链式反应的重复循环而不需

要在每一合成加成过程开始时添加新鲜的酶。DNA聚合酶特

别是热稳定聚合酶，是重组DNA研究和疾病的医疗诊断中大

量技术的关键。特别是对于诊断应用，靶核酸序列可能仅仅

是所考察(inquestion)DNA或RNA的一小部分，因此不扩

增的话可能难以检测到靶核酸序列的存在。聚合酶的总体折

叠模式类似人的右手，包括手掌、手指和拇指三个独特的亚

结构域。(参见Beese等，Science

260:352-355,1993)；Patel等，BioChemistry34

5351-5363,1995)。尽管在大小和细胞功能不同的聚合酶之

间手指和拇指亚结构域的结构变化很大，但催化性的手掌亚

结构域全部都是重叠的(superimposable)。例如，与引入

的dNTP相互作用并在化学催化作用期间稳定过渡态的基序

A是重叠的，在哺乳动物ροα和原核生物的polI家族

DNA聚合酶之间的平均偏差大约为1人(Wang等，Cell89

1087-1099,1997)。在结构上基序A以主要包括疏水性残基

的反向平行β链起始，延续到α-螺旋。DNA聚合酶活性位

点的主要氨基酸序列是特别保守的。基序A的例子中，例

如，序列DYSQIELR(SEQIDNO:30)保留在从数百万年进化的

生物体包括例如水生栖热菌(Thermusaquaticus)、沙目艮

衣原体(Chlamydiatrachomatis)禾口大肠杆菌

(Escherichiacoli)分离的聚合酶中。把这些观察结果联系

在一起，它们指出聚合酶通过类似的催化机理行使功能。除

了高度保守之外，DNA聚合酶的活性位点也被证明是相对易

变的，能够接受特定的氨基酸取代而不显著降低DNA聚合酶

活性。(参见例如I^atel等的美国专利号6，602，695)。这

样的突变型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反应的诊断

和研究应用中提供各种选择优势。本发明，如同在此阐述的，

满足这些及其它需要。发明概述本发明提供了相对于相应的

未经修饰的聚合酶具有改良的酶活性的DNA聚合酶，它可以

用于多种核酸合成应用中。在一些实施方式中，聚合酶是分

离的或纯化的。在一些实施方式中，DNA聚合酶包含氨基

酸序列

A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8-X9-Xltl-X11-L-X

12-X13-X14-X15(SEQIDN0:1)，其中X2,X5,X6,X9,和

Xltl是任何氨基酸，amp;是!^或0，是N或H，)(4是1^

或I，X7是D，K或T，)(8是1^或V，X11是