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抗体是指能与对应抗原特异性结合含有免疫功效球蛋白。
抗体产生:机体免疫系统受抗原刺激后,B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞,由浆细胞合成和分泌球蛋白。
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20世纪60年代发觉多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类似球蛋白,统称为免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。所以Ig是化学结构概念,而抗体是生物学功效概念。
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多克隆抗体:病原微生物含有各种抗原决定簇抗原物质,所以这些抗体制剂也是各种抗体混合物,故称多克隆抗体。
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1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体(monoclonalantibodyMcAb)。
单克隆抗体含有高度特异性、均一性、起源稳定、可大量生产等特点,为抗体制备和应用提供了全新伎俩,还促进了基础和临床医学发展。
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单克隆抗体作为抗体制剂,在临床上主要用与疾病诊疗和治疗。
单克隆抗体检测与一些疾病相关抗原,辅助临床诊疗。用放射性核素标识单克隆抗体进行肿瘤显像,做免疫定位诊疗。
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单克隆抗体用于临床治疗,CD3单克隆抗体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。
以单克隆抗体作为载体药品对肿瘤进行定向治疗。
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第二节单克隆抗体
单克隆抗体是将抗体产生细胞与含有没有限增殖能力骨髓瘤细胞相融合,经过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一单克隆细胞系而产生。
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一、抗原与动物免疫
制备特定抗原单克隆抗体,首先要制备用于免疫适当抗原,再用抗原进行动物免疫。
有抗原能够用化学合成:地高辛
多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。
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为使杂交瘤细胞稳定,免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。
当前惯用骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和LOU大鼠,所以免疫动物也采取对应品系。
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免疫方法采取体内免疫法和体外免疫法。
体内免疫法适合用于免疫原性强、抗原量较多时应用,普通用8~12周龄雌性鼠。
颗粒性抗原(如细菌细胞抗原)免疫原性强,可不加佐剂,直接注入腹腔10个细胞进行首次免疫,间隔1~3周,再追加免疫1~2次。
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可溶性抗原按每只小鼠10~100μg
抗原与福氏完全佐剂等量混合后注
入腹腔内,进行首次免疫,间隔
2~4周,再用不加佐剂原抗原追加免疫1~2次。
普通再采脾细胞前3日由静脉注射最
后一次抗原。刺激B细胞分裂。
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脾内免疫法即在麻醉下直接将
0.1~0.2ml抗原注入脾脏进行免疫。细胞抗原需105个,可溶性抗原需10μg。
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体外免疫法用于不能采取体内免疫情况下,如制备人源性单克隆抗体;免疫源性极弱,易引发免疫抑制。
优点:需抗源量少,免疫期短,干扰原因少。
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体外免疫法:用4~8周龄BALB/c
小鼠脾脏制成单细胞悬液,再加入适当抗原使其浓度达0.5~5μg/ml,在5%CO37C下培养4~5天,再分离脾细胞,进行细胞融合。
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二、细胞融合与杂交瘤细胞选择性培养
细胞融合方法:
脾细胞(1×10)
骨髓瘤细胞(2×10)混合
聚乙二醇诱导下融合,2分钟,然后用培养液将融合液迟缓稀释。
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用于细胞融合骨髓瘤细胞应含有融合率高,本身不分泌抗体,所产生杂交瘤细胞分泌抗体能力强,长久稳定。
PEG相对分子量4000,浓度为50%
二甲基亚砜增加融合率。
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细胞融合后可产生各种融合。
脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合细胞。
选择性培养:
培养基为HAT培养液。次黄嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。
A阻断DNA合成。
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三、筛选阳性克隆与克隆化
筛选阳性克隆惯用检测方
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