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Western-blot(蛋白印迹法)详细步骤

准备:裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000:10=100:1

若需要加入蛋白酶抑制剂,则比例一般为1:1000(即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂)

步骤:①将RIPA和PMSF按比例混匀,加入到装有组织粉末的EP管中,一般加入300~500μl左右(浓度尽量高点)。

②盖好盖子,在冰上裂解30~40min.

③到时间后于4℃,12000rpm离心10min,取上清液转移到新的离心管中,于-20℃保存。

注意:1.裂解液加入后用手指弹一下混匀,当加入量很少时,成粘稠状,有必要时应用枪头混匀。

BCA法测定蛋白浓度(BCA试剂盒)

准备:BCA试剂盒(BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液)、酶标板、酶标仪、摇床

步骤:①按1:15或1:30稀释待测样品,即取1μl样品+14μl水。

②按下表在酶标仪中加入试剂,绘制标准曲线。

孔号

0

1

2

3

4

5

6

蛋白标准液(μl)

0

1

2

4

6

8

10

去离子水(μl)

10

9

8

6

4

2

0

蛋白含量(μg)

0

1

2

4

6

8

10

③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)根据样品数量配制BCA工作液。

④每个标准品孔加入200μlBCA工作液,样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液,充分混匀,在摇床上震荡30s,37℃放置30min,于492nm下测定OD值。

⑤标准曲线以蛋白含量(μg)为横坐标,吸光度为纵坐标,根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。

注意:1.标准曲线一般做两组,取最好的标准曲线计算。

2.蛋白浓度=(蛋白含量/总体积)×稀释倍数[μg/μl]

3.保证样品液中的蛋白含量相同(500μg/100μl),则取10μl样品液中含有50μg蛋白。

4.样品液稀释液要再沸水浴中煮10min(可用微波炉加热),放凉至室温后于-20℃保存。

SDS蛋白质电泳

(一)、配胶

准备:凝胶液各成分、电泳板、制胶架、梳子

步骤:①选择适合电泳板(0.75mm:1.0mm:1.5mm),用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗,将玻璃板夹入玻璃板夹,注意底部对齐,夹好后卡到制胶架上。

②首先配制分离胶(一般用12%的SDS分离胶),按分离胶配方配制,配胶时最后加APS和TEMED,迅速混匀,注意减少气泡的产生。

③将配好的分离胶迅速加入玻璃板之间至梳子下约1cm处(绿色线处),不要有气泡。灌好胶后用蒸馏水覆盖胶层,加满蒸馏水至玻璃板顶端,以利于丙烯酰胺的聚合。室温静置约30min至胶层与水层检出现明显界限。若室温过低可将其置于37℃烘箱中。

④配制浓缩胶(5%的Arcymalide浓缩胶),混匀,注意减少气泡产生。

⑤带分离胶聚合后,倒掉上层水,将混匀的浓缩胶沿玻璃板壁小心加在分离胶上至较短玻璃板顶端,插好梳子,不能有气泡,室温静置20~30min至凝胶聚合。

注意:1.夹好玻璃玻璃板后用水检查其是否漏水。

2.12%分离胶配方:

不同体积(ml)凝胶液各成分所需体积(ml)

溶液成分

5

10

15

20

25

30

H2O

1.6

3.3

4.9

6.6

8.2

9.9

30%Arcylamide

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

1.0MTris-HCL(PH8.8)

1.3

2.5

3.8

5.0

6.3

7.5

10%SDS

0.05

0.1

0.15

0.20

0.25

0.30

10%APS

0.05

0.1

0.15

0.20

0.25

0.30

TEMED

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

0.012

3.SDS浓缩胶配方(5%Arcylamide)

不同体积(ml)凝胶液各成分所需体积(ml)

溶液成分

2

3

4

5

6

8

H2O

0.68

1.4

2.7

3.4

4.1

5.5

30%Arcylamide

0.17

0.33

0.67

0.83

1.0

1.3

1.0MTris-HCL(PH8.8)

0.13

0.25

0.5

0.63

0.75

1.0

10%SDS

0.01

0.02

0.04

0.05

0.06

0.08

10%APS

0.01

0.02

0.04

0.05

0.06

0.08

TEMED

0.001

0.002

0.004

0.005

0.006

0.008

4.配胶时加入的APS和TEMED是助凝剂,应最后加入,加入后应迅速将配好的胶灌入玻璃板之间,防止其凝固。

(二)、电泳

准备:电泳仪、电泳缓冲液、样品、

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