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用于长片段阅读测序的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于长片段阅读测序的方法和组合物的制作方法

用于长片段阅读测序的方法和组合物对相关申请的交叉引

用本申请要求2009年6月15日提交的美国专利申请No

61/187，162的优先权权益，在此通过提及而将其完整收

录。

背景技术：

大规模基因组序列分析是有助理解多种生物现象的一个关

键步骤。对低费用、高通量的测序和再测序的需求导致了新

的测序方法的开发，这些方法采用了同时对多个核酸目标物

的平行分析。常规的测序方法通常局限于在信号明显降解之

前可以确定几十个核苷酸，因此整个测序效率受到很大的限

制。常规测序方法还经常受限于信噪比，使得这类方法不适

合用于单分子测序。如果可以设计出能够提高测序反应效率

以及由较短阅读长度组装成完整序列的效率的方法和组合

物，整个领域将获益良多。发明概述因而，本发明提供了测

序反应方法和组合物。在一个例示性的实施方案中，本发明

提供了一种将双链靶核酸片段化的方法。此方法包括(a)提

供基因组DNA；(b)将DNA分成许多分开的等分试样

(aliquot)；(c)在存在包含dNTP类似物的dNTP群的情况

中扩增所述分开的等分试样中的所述DNA，使得DNA中的许

多核苷酸被dNTP类似物替换；(d)除去dNTP类似物以形成

有缺口的DNA，(e)处理有缺口的DNA以平移所述缺口，直至

相反链上的缺口会聚，由此创建平端DNA片段。在又一个实

施方案中，分开的混合物中的基本上每个片段与相同等分试

样的间隔(everyother)片段不重叠。在又一个实施方案中及

依照上述任何内容，本发明提供了一种用于使核酸片段化的

方法，其包括下列步骤(a)为至少一个基因组提供至少两个

DNA基因组等同物；(b)将DNA分成第一层分开的混合物；(c)

扩增分开的混合物中的DNA，其中用dNTP群进行扩增，所

述dNTP群包含预定的dUTP与dTTP比率(使得所述DNA中的

许多胸腺嘧啶被尿嘧啶替换)和预定的5-甲基dCTP与dCTP

比率，使得许多胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶替换；(d)除去尿嘧

啶和5-甲基胞嘧啶以形成有缺口的DNA；(e)处理有缺口的

DNA以平移所述缺口，直至相反链上的缺口会聚，由此创建

平端DNA片段，其中与在没有5-甲基胞嘧啶的情况中生成

的片段相比，平端片段具有更小的GC偏离(bias)和更小的

覆盖偏离。在又一个实施方案中，本发明提供了一种使双链

靶核酸片段化的方法，其包括下列步骤(a)提供基因组DNA；

(b)将DNA分成分开的等分试样；(c)扩增分开的等分试样中

的DNA以形成多个扩增子，其中用包含dNTP类似物的dNTP

群进行扩增，使得扩增子中的许多核苷酸被dNTP类似物替

换，且其中在存在选自下组的添加剂的情况中进行扩增糖原、

DMS0、ETSSB、甜菜碱及其任何组合，(c)自扩增子除去dNTP

类似物以形成有缺口的DNA；(d)处理有缺口的DNA以平移

所述缺口，直至相反链上的缺口会聚，由此创建平端DNA片

段，其中与在没有添加剂的情况中生成的片段相比，平端片

段具有更小的GC偏离。

在又一个实施方案中，本发明提供了自基因组获得序列信息

的方法，其包括下列步骤(a)提供所述基因组的第一片段群；

(b)制备第一片段的乳剂液滴，使得每个乳剂液滴包含第一

片段群的亚组；(c)获得每个乳液液滴内的第二片段群，使

得第二片段比衍生它们的第一片段短；(d)组合第二片段的

乳剂液滴与衔接头标签的乳剂液滴；(e)连接第二片段与衔

接头标签以形成加标签的片段；(f)将加标签的片段组合成

单一组合物；(g)自加标签的片段获得序列阅读，其中序列

阅读包括来自衔接头标签和片段的序列信息以鉴定来自相

同乳剂液滴的片段，由此提供关于基因组的序列信息。附图

简述

图1是用于使核酸片段化的方法的实施方案的示意图。图2

是用于使核酸片段化的方法的实施方案的示意图。图3是引

物浓度在MDA反应中对GC偏离的影响的图。图4显示了

DMSO和引物浓度在MDA反应中对变异性(图4A)和GC偏离(图

4B)的影响。图5显示了SSB(图5A)和甜菜碱(图5B)在MDA

反应中对GC偏离的影响。图6是用于生成包含多个衔接头

的环形核酸模板的本发明实施方案的示意图。图7是用于控

制插入靶核酸中的衔接头的取向的本发