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用于鉴定控制基因转录物和产物水平的调节基因座的基于

作图的基因组开采方法

专利名称：用于鉴定控制基因转录物和产物水平的调节基因

座的基于作图的基因组开采方法

技术领域：

本发明涉及一种用于在任何生物体内鉴定控制基因表达的

调节基因座的方法。更具体地讲，本发明涉及利用mRNA转

录物和转录物水平的改变鉴定与一种生物体内需要的性状

相关的定量性状基因座。

背景技术：

在植物育种程序中，理想植物性状的筛选通常是基于一种或

多种表型性状的选择。不过，很多重要的农艺性状是复杂的，

并且受到环境的显著影响，受多基因控制，就是说一种表型

性状是由多个基因调节的，而不是由一个基因所调节的。在

受多基因或多个基因控制的性状中，在很多基因座上的等位

基因的表达可能产生感兴趣的表型。

业已多次证实，有很多基因不能根据发育或环境线索表达。

特别是在转基因生物中，对控制所述基因表达的因素的了解

是重要的，例如，导入一个外源基因以便控制其在发育、组

织或胁迫依赖型方式中的转录物水平。这种研究发现了存在

于基因表达中控制的复杂性和多级冗余性。基因表达的控制

机制在不同基因之间可能有很大差异(例如，参见Hirt

H.1999TrendsPlantSci.47-8)。在特定环境或发育条件下，

与特定过程相关的基因并非总是以类似方式作出反应，它们

也不是在相同的细胞类型或组织中积累，这表明它们能对不

同的控制或信号机制作出反应。

使用现有的技术难于从整个事件级联中筛选出控制感兴趣

的基因表达的关键调节基因。

业已用多种方法鉴定了差异表达的基因，如cDNA文库的差

异筛选，基因组测序与基因库中同源性筛选的组合，基因剔

除和互补，同源异型基因的突变，用高密度基因阵列对ESTs

进行高通量筛选。这些方法尽管烦琐，但是业已偶尔被用于

鉴定与基因表达调节相关的基因，不过，这些方法不是为了

这种目的而专门设计的。用于鉴定控制基因表达的因素的基

因剔除方法(突变体变异)适用于诸如拟南芥属的小型基因组。

这种技术同样是烦琐的，不特异的，并且通常会导致无法检

测或致死突变表现型。可以将诸如mRNA类型差异展示、扣

除或统一化文库以及基因排列的技术组合用于挑选调节基

因。不过，这种技术对于单一基因表达的分析没有特异性，

并且浪费时间。另外，对于这些技术来说，感兴趣的调节基

因的转录物必须存在于用于制备文库的样品中，以便鉴定该

转录物。当涉及到不同步表达的多个调节基因时，所述任务

就无法实现。

数量性状基因座(QTL)是基因组的一个区域，它编码一种或

多种蛋白，并且解释可能由多个基因控制的特定表型的变异

性的显著比例。通常，可以用一种或多种遗传标记鉴定需要

的QTL。迄今为止，植物物种的大多数QTL研究都是观察总

的形态学或农艺表型(例如，产量、抗病和抗胁迫性，开花

时间等)。例如，在WO2000/18963中，披露了包括与提高了

的产量相关的QTL的大豆植物，以及用于筛选和培育这种植

物的方法。该方法涉及能够与第二种核酸分子杂交的特殊标

记核酸的使用，该标记作图于大豆特定部分，并且与提高了

的产量相关。在US5,948,953中，在大豆植物中鉴定了与褐

茎腐病抗性(BSR)抗性相关的QTL。可以将与BSR抗性相关的

QTL用于通过标记协助的筛选来筛选植物。WO99/31964披露

了将与一组63个特定的基因座遗传连锁的标记核酸用于植

物筛选。所鉴定的多态性可用于DNA指纹分析，并用于对与

抗虫或抗病相关的基因或QTLs进行作图。若干最新QTL研

究业已揭示了特定代谢变化的数量变异之间的关系，包括代

谢物的积累或酶活性的改变。例如，Byrneetal(Byrne，

P.F.，McCulen，M.D.，Snook，M.E.，Musket，T.A.，

Theuri，J.M.，Widstrom，N.W.，Wiseman，B.R.和

E.H.Coe.1996.Proc.Natl.Acad.Sci.938820-8825)披露了

控制maysin——一种起着抗玉米穗虫的宿主植物抗性因子

作用的黄酮的浓度变异的58％的QTL的作图位置位于编码

类黄酮途径一部分的转录激活物的基因座上。Prioul

et.al.(Prioul，J.-L.，Quarrie，S.，Causse，M.andD.de

Vienne.1997.J.Exp.Bot.481151-1163；Prioul，J.-L.，

Pelleschi，S.，