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小分子与蛋白体外相互作用测定方法

⊙编辑：小余

生物分子相互作用是一种基本的生命现象，其相互作用研究是现

代生命科学研究的重大问题之一。现在研究相互作用的技术有：平衡

透析法、紫外可见吸收光谱、荧光光谱、电化学法等。随着分子生药

研究深入，一些新的检测技术问世，如微量热泳动技术（MST），那

么当我们做蛋白相互作用时，面对如此多的技术，该如何让选择？笔

者将目前测定小分子与蛋白的体外相互作用，最常用的四种技术：荧

光偏振免疫分析法（fluorescencepolarizationimmunoassay，

FPIA）、等温量热滴定仪（ITC）、表面离子体共振技术（SPR）等技

术的原理、操作、应用范围以及优缺点做一综述，供各位研究者参考。

其中FPIA和ITC是两种经典方法。

1.荧光偏振免疫分析法（fluorescencepolarization

immunoassay，FPIA）

1.1原理

FPIA是一种定量免疫分析技术，其基本原理是荧光物质经单一平

面的蓝偏振光（485nm）照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复到

基态，并发出单一平面的偏振荧光（525nm）。偏振荧光强弱程度与

荧光分子的大小呈正相关，与其激发时的转动速度呈反相关。FPIA最

适宜检测小至中等分子物质，常用于药物、激素的测定。

1.2操作

1.2.1首先针对所测蛋白，选择一个阳性药物，对阳性药物进行荧

光标记；

1.2.2配制一系列浓度的标准抗原（厂家在试剂盒中提供提供已知

剂量的非标记抗原）；

1.2.3用一系列已知浓度的标准抗原与一定量的标记抗原在一定条

件下同限量的特异性抗体进行反映；

1.2.4反应达到平衡后，以反应变量作为纵坐标，反应剂量（一系

列标准抗原）作为横坐标，做一条曲线，就得到不同浓度的标准抗原

对反应变量的竞争抑制曲线；

1.2.5在同等条件下，用待测抗原与一定量的标记抗原与限量的特

异性抗体进行反应，并用同样的方法分离待测抗原中的B和F，测量其

放射性，计算出B/F，在剂量反应曲线上就可以查出对应的抗原浓度。

1.3注意

在实际操作中要设置：一是标准抗原量为0，这是没有标准抗原与

标记抗原竞争，标记抗原和抗体结合达最大值；二是为了排除标记抗

原再发特异性结合时出现非特异性结合（与杂质蛋白和容器的管壁结

合等），设置一个非特异性结合管(NSB)，NSB管用蒸馏水代替特异

抗体，在相同条件下反应后测的放射性。

1.4优缺点

1.4.1优点

检测限低，0.2ng/ml，精密度高，速度快，样品用量少，仪器不

用每日校准，有颜色和浑浊的溶液不干扰检测结果；

1.4.2缺点

仪器设备昂贵，药品试剂盒专属性强，需进口，测一种特异性抗

体，需要一种标记抗原。

2.等温量热滴定仪（ITC）

2.1原理

ITC是一种量热或分析技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，

随着加入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化。滴定一般

在尽可能接近绝热的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬浮的固体；

滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定物间的化学

作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引起的。在一

次实验中可以测定结合的亲和力常数K，结合反应中的焓变、熵变，结

合位点，也可以测定有多个结合位点的样品。

2.2操作

2.2.1样品池中加入待测大分子；

2.2.2参照池中加入缓冲液；

2.2.3将待测配体吸入注射器中；

2.2.4注射器置于样品池中；

2.2.5调整温度、搅拌速度和每次注射体积。

2.3应用

分子相互作用（蛋白、核酸、多肽、药物分子、脂类、金属离子、

小分子等等）、工艺过程的开发和控制、酶动力学、药物研发、非生

物系统等。

2.4优点

2.4.1无需荧光标记，因为荧光素对大