细胞生物反应器制药专家讲座.pptxVIP

第三章细胞工程制药

—转基因动物与生物反应器;2;外源目标基因制备

外源目标基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞

选择取得携有目标基因细胞

选择适当体外培养系统和宿主动物

转基因细胞胚胎发育及判定

筛选所得转基因动物品系;以绿色荧光蛋白转基因小鼠为例：;microinjection;Transgeneanalysis;Phenotypicanalysis;Gurdonetal,Nature,1971,(蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA)---显微注射技术尝试

Jaenisch，PNAS,1974,1976，逆转录病毒感染小鼠囊胚，使病毒DNA整合到小鼠基因组中，并传递给后代---不能广泛应用，只是少数ES细胞整合外源基因，部分组织有外源基因

Gordonetal,PNAS,1980;Brinsteretal,Cell,1981;CostantiniLacy,Nature,1981;Wagneretal,PNAS,1981---显微注射技术建立，基因结构没有合理和认真设计，不能分析基因生理功效;Palmiter,Brinster,Hammeretal,1982,Nature(MT-GH)---超级小鼠

其它功效基因---基础研究中一直使用

Hammeretal,1985,Nature(rabbit,sheep,pig)

GH为主，开始关注转基因动物病理改变

;TMtransgenemice

Denningetal,

NatBiotech.(GTPrP)

Daietal,,

NatBiotech(GT-outpig)

Laietal,,

Science(GT-outpig)

GT:半乳糖转移酶;外源基因导入动物细胞方法：; 原核期胚胎显微注射：

创始人Jaenish（1974),主要步骤：公母畜交配（或经过人工授精）取得原核期受精卵，外源裸露DNA经过徽注射导入受精卵，然后将徽注射后受精卵移入受体输卵管中继续发育。;经过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，48小时后再注射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，普通情况下5-10个，超数排卵为35个；

与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵

将经纯化转基因样品快速注射入受精卵中变大雄性原核内

将25-40个注射了转基因受精卵移植入代孕小鼠体内；

受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代；

从小鼠子代体内取出DNA样品，进行杂交，判定转基因整合是否及位点；

子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表示;2021/10/4;2021/10/4;2021/10/4;反转录病毒感染法：

利用反转录病毒LTRs（长末端重复序列）区域含有???录开启子活性特点，将外源基因连接到LTR下部进行重组，再包装成为高滴度病毒颗粒，去直接感染受精卵或徽注入囊胚腔中，携带外源基因反转录病毒DNA能够整合到宿主染色体上。;2021/10/4;胚胎干细胞介导法：将目标基因转移入ES，重新导入囊胚或经筛选后对转入外源基因ES进行克隆，可培育转基因个体。在小鼠上应用成熟，大动物较晚。从猪胚胎中取得了干细胞克隆系1988，牛胚胎干细胞1990。建立大家畜ES细胞系仍很困难，但伴随一些相关关键技术成熟，ES细胞介导法将会在转基因动物研究中起到愈加主要作用;精子载体法;受精前卵细胞显微注射法;2021/10/4;

;普通把目标片段在器官或组织中表示转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产角度考虑，生物反应器选择组织和器官要方便产物取得，比如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器研究最为引人注目。;※医药领域应用

a.抗出血药品

b.抗凝血药品

c.血栓治疗药品

d.肺气肿治疗药品

e.免疫治疗药品

f.人型化单克隆抗体;应用转基因动物/乳腺生物反应器生产药用蛋白是药品生产一个全新模式，含有投资成本低、

药品开发周期短和经济效益高等优点，将成为21

世纪最含有巨额经济利润新型医药产业。;动物乳腺生物反应器;2021/10/4;

;当前用于表示载体开启子调控元件主要有四类乳腺定位表示调控元件：第一类是B2乳球蛋白(BLG)，第二类是酪蛋白基因调控序列：第三类是乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列；第四类是乳清白蛋白基因调控序列。

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