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7.2.7利用慢病毒构建RB1过表达细胞系
构建过表达细胞系是利用慢病毒pLVX-IRES-ZsGreen1系统，该系统是由一个载体质粒和三个辅助质粒所构成，如表7.1所示：
表7.1pLVX-IRES-ZsGreen1系统组成
质粒功能
质粒名称
质粒大小（bp）
载体质粒
pLVX-IRES-ZsGreen1
8204
辅助质粒
REV
4180
辅助质粒
VSVG
5821
辅助质粒
PRRE
8889
RB1基因PCR并设计酶切位点，Xhol/BamH1,将目的基因插入到pLVX-IRES-ZsGreen1载体上，图谱如图7.1，载体构建与普通载体构建规则相同。载体构建完成以后，便可进行慢病毒的包装与感染。
构建过表达细胞系RB1PCR扩增的上游引物是：5’-GAGCATGTCAGATCTCGAGATGCCGCCCAAAACCCCCCGAAAAACGGCC-3’；下游引物是：5’-GTGACGTCAGGATCCCGTCATTTCTCTTCCTTGTTTGAGGTATCCATGCT-3’。
图7.1pLVX-IRES-ZsGreen1载体的质粒图谱及多克隆位点处的酶切位点
7.2.7.1慢病毒颗粒的包装
步骤如下：
提前1天在一个100mm培养皿上铺上293T细胞。
待293T细胞长满皿底70%-90%面积时，开始进行病毒包装：
按下表配置转染复合物
转染复合物成分
添加量
DMEM培养基
15ml
PEI（1μg/ul）
48μl
pLVX-IRES-ZsGreen1
20μg
REV
10μg
VSVG
10μg
PRRE
15μg
将上述转染复合物摇匀，室温静置30min。
向转染复合物中加入FBS，使终浓度为5%。
将293T细胞中培养基弃去，加入转染复合物。
5-6h后，去除培养皿中的转染复合物，加入15ml正常培养基。
24h后，向转染的100mm培养皿中再加入10mlDMEM培养基（含5%FBS）。
48h后，收集100mm培养皿中的上清，弃沉淀。保存于-80oC。此含慢病毒颗粒的上清可以直接使用，感染目的细胞；如果感染效果不好，可以进行慢病毒的浓缩。
7.2.7.2慢病毒颗粒的浓缩
步骤如下：
病毒上清液按下表配成浓缩准备液（假设10个100mm培养皿共得到210ml上清液）：
成分
含量
病毒上清液
210ml
50%PEG6000
51ml
4MNaCl
21.7ml
PBS
补足至300ml
将述浓缩准备液混匀，4oC，1.5h，每20-30min摇匀一次。
将准备液4oC，7000g，10min。弃上清，PBS重悬沉淀（50ml浓缩准备液大概用1mlPBS溶解），即为浓缩的慢病毒颗粒。保存于-80oC待用。
7.2.7.3慢病毒感染目的细胞
步骤如下：
待目的细胞处于对数生长期时，加入适量的慢病毒颗粒溶液。加入慢病毒的同时可选择加入助感染试剂Polybrene（终浓度6-10μg/ml）。
感染后，观察细胞状态。感染8-12h后，换正常培养基。
细胞继续培养，72h后，荧光显微镜下观察，可见被慢病毒所感染的细胞表达GFP。根据GFP的亮度利用流式细胞仪分选出GFP阳性的细胞，继续培养即得稳定过表达Rb的细胞系。
7.2.8利用慢病毒构建RB1敲低细胞系
构建敲低细胞系是利用慢病毒pLL3.7系统，该系统是由一个载体质粒和三个辅助质粒所构成，如表7.2所示：
表7.2pLL3.7系统组成
质粒功能
质粒名称
质粒大小（bp）
载体质粒
pLL3.7
7650
辅助质粒
pMD2.G
5824
辅助质粒
pRSVRev
4174
辅助质粒
pMDLgpRRE
8895
设计合成RB1shRNA并带酶切位点，Hpal/Xhol,将shRNA插入到pLL3.7载体上，图谱如图7.2。载体构建完成以后，便可进行慢病毒的包装与感染。
设计合成的RB1shRNA如表7.3所示：
表7.3RB1shRNA的引物序列
shRNA种类
引物序列
shRNA1
正向
5’-TAGAACATGAATGTAATATATTCAAGAGATATATTACATTCATGTTCTTTTTTC-3’
反向
5’-TCGAGAAAAAAGAACATGAATGTAATATATCTCTTGAATATATTACATTCATGTTCTA-3’
shRNA2
正向
5’-TGCAGTTGACCTAGATGAGATTCAAGAGATCTCATCTAGGTCAACTGCTTTTTC-3’
反向
5’-TCGAGAAAAAGCAGTTGACCTAGATGAGATCTCTTGAATCTCATCTAGGTCAACTGCA-3’
shRNA3
正向
5’-TGATACCAGATCATGTCA
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