《化妆品防腐剂挑战测试评估技术指南》.doc

附件2

化妆品防腐挑战测试

评估技术指南

中国食品药品检定研究院

目录

TOC\o1-3\h\z\u1.范围 1

2.术语和定义 1

3.设备和材料 1

4.培养基和试剂 2

5.测试菌株 3

6.测试方法 3

7.说明 10

附录A 11

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1.范围

本指南规定了化妆品防腐效能的评价方法。

本指南适用于化妆品防腐体系效能评价。

2.术语和定义

2.1防腐效能评价试验

将一定量的微生物人工污染到化妆品中，模拟化妆品可能出现的污染情况，每隔一定时间检测其中的存活菌量，根据存活菌量的变化评价化妆品防腐体系效能的试验方法。

2.2中和剂

可添加至化妆品和微生物混和物中，消除化妆品中抑菌或杀菌成分对微生物抑制或杀灭作用的试剂。

3.设备和材料

3.1A2型生物安全柜。

3.2高压蒸汽灭菌器。

3.3天平：感量为0.1g。

3.4恒温培养箱：36℃±1℃、28℃±2℃、25℃±2℃。

3.5均质器。

3.6无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。

3.7显微镜。

3.8酸度计。

3.9涡旋混匀器。

3.10灭菌平皿：直径90mm。

3.11无菌玻璃棉。

4.培养基和试剂

4.10.85%生理盐水。

4.2卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，见附录A.1。

4.3虎红（孟加拉红）培养基，见附录A.2。

4.4含0.05%(v/v)聚山梨酯80的生理盐水，见附录A.3。

4.5胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），见附录A.4。

4.6沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)，见附录A.5。

4.7SCDLP液体培养基，见附录A.6。

4.8EugonLT100肉汤，见附录A.7。

4.9D/E中和肉汤，见附录A.8。

4.10改良Letheen肉汤，见附录A.9。

5.测试菌株

5.1细菌

金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003

大肠埃希氏菌CMCC（B）44102

铜绿假单胞菌CMCC（B）10104

5.2真菌

黑曲霉CMCC（F）98003

白色念珠菌CMCC（F）98001

在进行化妆品防腐效能评价试验时，可根据需要增加其他相关细菌或真菌作为测试菌株。

6.测试方法

6.1供试品微生物检测

取不少于2份包装完好的供试化妆品样品，依据《化妆品安全技术规范》第五章微生物检验方法中微生物检验方法总则、菌落总数、霉菌和酵母菌检验方法对样品进行检测，检测结果应符合《化妆品安全技术规范》中的限值规定。供试品微生物检测的结果记作Nf。

6.2微生物悬液制备

6.2.1细菌悬液制备

用接种环从菌种保存管中（或试管斜面上）取适量菌体，分区划线接种于TSA平板，36℃±1℃培养18h~24h。用接种环取第1代培养物，分区划线接种于TSA平板，36℃±1℃培养18h~24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，分区划线接种于TSA平板，36℃±1℃培养18h~24h，即为第3代培养物。用无菌棉签取菌苔加入无菌生理盐水中，涡旋混匀。用无菌生理盐水将其稀释成约107CFU/mL~108CFU/mL的菌悬液。制备好的菌悬液应在2h内使用，或在2℃~8℃保存不超过24h。

6.2.2白色念珠菌菌悬液的制备

用接种环从菌种保存管中（或试管斜面上）取适量菌体，分区划线接种于SDA平板，28℃±2℃培养48h~72h。用接种环取第1代培养物，分区划线接种于SDA平板，28℃±2℃培养48h~72h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，分区划线接种于SDA平板，28℃±2℃培养48h~72h，即为第3代培养物。用无菌棉签取菌苔加入无菌生理盐水中，涡旋混匀。用无菌生理盐水将其稀释成约106CFU/mL~107CFU/mL的菌悬液。制备好的菌悬液应在2h内使用，或在2℃~8℃保存不超过24h。

6.2.3黑曲霉孢子悬液的制备

用接种环从菌种保存管中（或试管斜面上）取适量的菌体，分区划线接种于SDA平板上，28℃±2℃培养3d~7d。用无菌棉签取菌苔加入含0.05%(v/v)聚山梨酯80无菌生理盐水中，制备孢子悬液，轻轻振摇1min后，用无菌玻璃棉过滤除去菌丝。用含0.05%(v/v)聚山梨酯80无菌生理盐水将其稀释成约106CFU/mL~107CFU/mL的孢子悬液。制备好的孢子悬液应当天使用或在2℃~8℃保存不超过7d，使用前混合均匀，并在显微镜下观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则弃之不用。

表1测试菌株培养条件

培养基

培养温度

培养时间

金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003

TSA

36℃±1℃

18h~24h

大肠