实验一蛋白质含量测定考马斯亮蓝染色法课件.pptVIP

第1页，幻灯片共31页Pleasebequiet,上课了！！第2页，幻灯片共31页1、学习利用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理及方法；2、掌握分光光度计的使用方法；3、掌握标准曲线的绘制。一、实验目的：第3页，幻灯片共31页考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中游离状态下为棕红色。当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色.蛋白质染料复合物对595nm可见光有最大光吸收.在一定范围内（10-1000ug/ml）其OD595nm值与蛋白质含量成正比，故可用分光光度法进行蛋白质的定量测定。二、实验原理：第4页，幻灯片共31页考马斯亮蓝G-250染色法原理465nm595nm酸性环境下呈棕红色与蛋白质结合变蓝色加入蛋白质第5页，幻灯片共31页双缩脲反应：Folin-酚试剂法（Lowry法）：紫外吸收法：微量凯式定氮法：其他蛋白质含量的测定方法第6页，幻灯片共31页（1）双缩脲法：原理是蛋白质含有两个以上的肽键（-CO-NH-）因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，故可以用来测定蛋白质含量.第7页，幻灯片共31页（2）Folin-酚试剂法（Lowry法）：是双缩脲法的发展，第一步涉及到碱性溶液中铜蛋白质复合物的形成，然后这个复合物还原磷钼酸－磷钨酸试剂，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）比双缩脲法灵敏，但费时；第8页，幻灯片共31页（3）紫外吸收法：蛋白质中Trp，Phe，Tyr的残基中的苯环含有共轭双键，吸收高峰在280nm处，所以蛋白质具有吸收紫外光的性质，并且蛋白质溶液的光吸收值与其含量成正比，可用作定量测定。简单、灵敏、快速、不耗样品，低浓度的盐类不干扰。第9页，幻灯片共31页（4）微量凯式定氮法：根据蛋白质的平均含氮量为16%，因此，测得1g蛋白氮，相当于6.25g蛋白质。第10页，幻灯片共31页1、实验材料：豆芽2、仪器：(1)S-22pc可见光分光光度计(2)研钵(3)离心机(4)试管(5)容量瓶等3、试剂：（1）染色液：考马斯亮蓝G-250(100mg考马斯亮蓝溶于50ml95%乙醇，加100ml85%磷酸，加水稀释至1L)（2）浓度：0.25mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液。三、实验材料、仪器和试剂：第11页，幻灯片共31页1、制作标准曲线：取7支试管，依次分别加入0.0，0.10,0.15,0.20,0.30,0.40,0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水补足到0.5ml，每管均再加5ml染色液，立即摇匀，置室温下放置5分钟。然后测各管的OD595nm值，绘制标准曲线。四、实验步骤：第12页，幻灯片共31页制作标准曲线：编号1(空白）234567样品标准蛋白(ml)0.00.10.150.20.30.40.50.5ml水(ml)0.50.40.350.30.20.10.0浓度(mg/ml)0.00.050.0750.10.150.20.25C0染色液(ml)55555555OD值第13页，幻灯片共31页标准蛋白质浓度OD值0样品OD值C00.050.0750.10.150.20.25OD1OD2OD3OD4OD5OD6标准曲线的制作（图）y=ax+bR2=第14页，幻灯片共31页标准曲线的绘制目的：得到样品中蛋白质的浓度。首先，用一组已知浓度的蛋白质溶液与考马斯亮蓝G-250反应,然后在595nm处测定吸光度（OD）。其次，绘制浓度与吸光度对应的曲线图。最后，测定样品蛋白质的吸光度然后在曲线上找到对应的浓度。第15页，幻灯片共31页称取豆芽叶片2g→研钵中加2ml水→研成匀浆→转入离心管→用水分三次冲洗研钵，每次2ml→均转入同一离心管→等重后4000转/分离心15分钟→取上清液转入25ml容量瓶→定容。2、样品蛋白质提取：第16页，幻灯片共31页吸取0.5ml提取液于试管中,加入考马斯亮蓝G-250染色剂5ml，充分混匀，放置5分钟，测OD595nm，记录结果，查曲线，得蛋白质浓度C0(mg/ml)。3、测定：第17页，幻灯片共31页分光光度技术利用紫外