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第54讲基因工程的基本工具和操作程序(二)选择性必修3一轮复习
重组DNA技术的基本工具一基因工程的基本操作程序二目录DNA的粗提取与鉴定、PCR及电泳鉴定三
基因工程的基本操作程序二第一步:目的基因的筛选与获取第二步:基因表达载体的构建第三步:将目的基因导入受体细胞第四步:目的基因的检测与鉴定前提核心关键保证
基因工程的基本操作程序二1.目的基因主要指的是编码蛋白质的基因在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。实例:与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。2.筛选合适目的基因筛选方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
基因工程的基本操作程序二①从生物组织中直接获取②从基因文库中获取③人工合成④利用PCR获取和扩增目的基因基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成基因组文库(某生物全部基因)部分基因文库(主要是cDNA文库)前提:方法:3.获取目的基因常用的方法
目的基因的筛选与获取某种生物体内全部DNA适当的不同限制酶切割与质粒连接导入受体菌基因组文库
目的基因的筛选与获取基因组文库每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。这个群体包含了这种生物的所有基因,叫做这种生物的基因组文库。该受体菌群为基因组文库
目的基因的筛选与获取cDNA文库cDNA文库如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段,与载体连接后储存在一个受体菌群中,那么,这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。某种生物体内的全部DNA某个时期基因选择性表达转录转录转录转录mRNA翻译翻译翻译翻译蛋白质
基因工程的基本操作程序二PCR扩增(聚合酶链式反应)根据DNA半保留复制的原理,在体外(PCR扩增仪)提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。原理操作环境缓冲溶液、DNA模板、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、与两条模板链结合的2种引物。目的及优点:可在短时间内大量扩增目的基因
基因工程的基本操作程序二PCR技术与DNA复制过程比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温下变性解旋场所主要在细胞核内细胞外(主要在PCR扩增仪内)酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)温度细胞内温和条件控制温度,需在不同温度下进行结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因联系①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料:均为四种脱氧核苷酸(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物,使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
微量离心管缓冲液PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。DNA模板四种脱氧核苷酸(dNTP)引物分别与两条模板链结合的2种引物耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)基因工程的基本操作程序二
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)4种脱氧核苷酸(dNTP)引物待扩增的DNA片段(模板)5’5’变性复性延伸温度上升到90℃以上,双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。基因工程的基本操作程序二过程
一个DNA,一对引物(A与B),复制n次子代DNA分子等长的DNA分子数为:_________个子代DNA分子中不等长链DNA分子数为:_________个子代DNA分子中含模板链DNA分子数为:__________个子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子数为:____个复制过程中共需引物________个第n次复制需要引物_________个2n-2n2n22n-12n+1-22n过程基因工程的基本操作程序二
基因工程的基本操作程序二产物鉴定PCR过程可以在PCR扩增仪中自动完成,完成以后,常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
较小DNA片段在凝胶中移动相对容易,较大的DNA片段移动难。电泳结束时,比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准),这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。基因工程的基本操作程序二产物鉴定
基因工程的基本操作程序二第一步:目的基因的筛选与获取第二步:基因表达载体的构建第三步:将目的基因导
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