实时荧光PCR技术临床适用范围.pdfVIP

WS/T230—2024

附录A

（资料性附录）

常用实时荧光PCR技术方法

A.1实时荧光定量PCR技术

A.1.1实时荧光定量PCR技术（荧光探针法）

基于荧光探针的实时荧光定量PCR技术目前在临床广泛被使用。该技术在反应体系中加入了一段荧

光标记的特异性寡核苷酸探针，探针的5’和3’端分别标记有报告荧光基团（Reporter，R）和淬灭荧光

基团（Quencher，Q）。探针完整时R基团所发射的荧光能量被Q基团吸收，不发出荧光。探针与模板特

异性结合后，在延伸阶段，TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性会将探针5’端连接的报告荧光基团水

解，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而发出荧光。检测到的荧光强度与PCR产物量成正比，从而

可推算出目的片段的起始量。实时荧光定量PCR技术扩增后无需开管操作，可降低污染风险。此外，实

时荧光定量PCR技术还具有特异性高、定量准确、实验耗时短、兼容性好等优势，已被广泛应用于临床

工作中。

A.1.2实时荧光定量PCR技术（荧光染料法）

该技术在反应体系中加入荧光染料，荧光染料不与ssDNA链结合，且在游离状态下不发出荧光。染

料随扩增反应的延伸循环掺入dsDNA，与小沟结合后发出荧光，荧光信号强度与产物的数量呈正相关。

荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，目前应用最广泛的染料是SYBRGreenI。尽管荧光染料

法的特异性低于探针法，但由于其成本更低，易于普及应用。

A.1.3多重荧光PCR技术

多重荧光PCR技术指在同一个PCR反应体系中，使用多对引物/探针，对多种目标序列同时进行扩增

的方法。多重PCR技术既兼有单一反应PCR的高特异性和灵敏度，同时具有高效和经济的特点，可同时检

测多种目标序列，例如多种耐药基因、多种病原体基因，尤其适用于珍贵样本。然而多重荧光PCR技术

对反应体系的平衡有更高要求，例如荧光标记间、多对引物及探针间的相互干扰，宜不断进行优化，以

减少存在多种靶标时可能出现的扩增偏好性。

A.1.4扩增阻滞突变系统PCR技术（amplificationrefractorymutationsystemPCR，ARMS-PCR）

扩增阻滞突变系统PCR技术亦称等位基因特异性PCR，用于对已知突变基因进行检测。该技术设计有

两个5’端引物，一个与野生型互补，一个与突变型互补。对于纯合性突变，分别加入两种5’端引物及

3’端引物进行平行PCR，只有与突变完全互补的引物才可延伸并得到扩增产物。如错配位于引物的3`

端则导致延伸反应无法进行。ARMS-PCR法检测灵敏度高，可检测肿瘤细胞中突变比例为1％甚至更低的

突变基因。

A.1.5高分辨率熔解曲线技术（highresolutionmelting，HRM）

高分辨率熔解曲线技术是一种基于实时荧光PCR的新方法，可用于检测基因突变、基因分型、单核

苷酸多态性以及甲基化修饰等。该方法在反应体系中加入了新型饱和染料，通过实时监测升温过程中荧

光染料与扩增产物的结合情况，根据不同熔解曲线形状和位置来判断是否存在基因突变或SNP。

A.2其他

基于实时荧光PCR技术的原理，目前还衍生有多种其他类型技术。对于RNA样本，可采用反转录实时

荧光PCR，通过反转录酶将RNA反转录为cDNA，再进行后续扩增。临床上，反转录聚合酶链反应（reverse

transcriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR）技术通常用于RNA病毒检测（例如丙型肝炎病毒、

人免疫缺陷病毒等）以及疾病相关mRNA转录产物的分析（例如非霍奇金淋巴瘤、白血病和肉瘤等伴随的

基因易位等）。此外，甲基化特异性PCR技术（methylationspecificPCR，MSP）也在临床疾病诊治中

有相关应用。同时，随着技术的不断发展，新一代实时荧光PCR技术例如数字PCR技术（digitalPCR，

dPCR）、微流控PCR技术、PCR技术阵列芯片等发展迅速，但在临床应用上仍处于探索阶段。