SD 大鼠骨骼肌卫星细胞的分离-江志辉.pptx

8原代分离实例—SD大鼠海马神经元细胞的分离CONTENTS目录7原代分离实例—SD大鼠骨骼肌卫星细胞的分离实践篇1

27、SD大鼠骨骼肌卫星细胞的分离

3目的与意义骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中位于细胞膜和肌膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性干细胞,负责骨骼肌的生长和损伤修复。近年来,国外有报道将肌卫星细胞移植到冻伤的骨骼肌中,可改善肌肉功能。另外,骨骼肌可能会通过分泌低分子量细胞因子即骨骼肌源性抑瘤物显著抑制肿瘤细胞生长。

4骨骼肌由骨胳肌细胞构成的一种肌组织，是横纹肌的一种。大多数骨胳肌都附着于骨上，是体内数量最多的组织，在人体中占体重的40%。ab

5骨骼肌卫星细胞肌卫星细胞指的是骨骼肌中除骨骼肌纤维（肌细胞）外的一种扁平、有突起的细胞。是位于肌肉纤维膜和基底膜之间的一种单核细胞，是动物出生后的骨骼肌的生长和再生的主要细胞来源。人骨骼肌卫星细胞：附着于肌纤维（肌细胞）表面；当肌纤维（肌细胞）受损后，肌卫星细胞可增殖分化，参与肌纤维（肌细胞）的修复，因此具有干细胞性质。c

6分离方法(参考)新生SD大鼠75%乙醇3-5min解剖并无菌分离后肢部肌肉冲洗，置入D-Hanks液中去除筋膜、血管及脂肪组织眼科剪将肌肉块剪成约1mm3大小D-Hanks液洗3次,静置1min后弃去上层液体及漂浮组织3天后观察细胞状态，定期换液或者传代加入0.1%胶原酶Ⅰ，置于37℃水浴锅中消化30min后，终止消化，离心，弃上清，D-Hanks液洗一遍完全培养基终止消化，反复吹打后，依次滤过100、200、400目的筛网，收集滤液1000r/min离心10min，弃上清，用生长培养基重悬细胞，将细胞悬液加入细胞培养瓶中37℃培养30min(连续2次)后（差数贴壁法去除成纤维细胞）移至培养瓶内用生长培养基进行培养向上述离心管中加入0.25%的胰蛋白酶，置于37℃水浴锅中消化15-20min，每隔5min摇动1次离心管，或用吸管吹打1次,使细胞分离、分散

71、取材时选取年幼或刚出生个体，比较容易分离得到肌卫星细胞（年幼个体的卫星细胞含量相对较丰富，在人和鼠中，出生时卫星细胞含量最多，约占所有肌细胞的30%，而出生后数月逐渐下降，成年鼠稳定在1-5%）；2、由于四肢骨骼肌中慢收缩肌的含量较多，因此一般均选择动物的四肢肌取材。我们选择大鼠后肢肌取材，可以保证取材的肌组织中含有的肌卫星细胞相对较多（有研究认为，慢收缩肌中卫星细胞数目为快收缩肌的3-4倍）；3、采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法，卫星细胞位于肌束的浆膜和基底膜之间这种特殊位置使其能抵抗一般消化酶的作用，Ⅰ型胶原酶只能消化肌束之间的连接，起到分离肌束的作用，而不能分离肌束上的卫星细胞，只有胰蛋白酶才有此能力；4、消化时间不宜过长，应控制在30min内，可以提高细胞存活率与贴壁率。采用胰蛋白酶分步消化法，多次消化，及时收集消化下来的细胞，既可以保证肌组织的充分消化，又可以避免蛋白酶对已消化下来的细胞的进一步损伤，以提高卫星细胞的活性；注意事项

85、过滤，即依次过100、200、400目的滤网，去除其中的肌纤维碎片和成纤维细胞；6、差速贴壁法（连续2-3次，每次30min）去除成纤维细胞，因为成纤维细胞相较于肌卫星细胞，胞体更大，贴壁速度更快，贴壁能力更强；7、由于结蛋白（Desmin）在成纤维细胞和血管平滑肌细胞中都有不同程度的表达，单纯以结蛋白（Desmin）鉴定肌卫星细胞会造成一定假阳性。因此结合横纹肌肌动蛋白（α-SMA）和结蛋白（Desmin）进行免疫焚光双标鉴定，结果更为可靠。注意事项

9操作演示：解剖并无菌分离后肢部肌肉12

10操作演示：冲洗，置入D-Hanks液中去除筋膜、血管及脂肪组织，剪碎，PBS吹打，静置，弃上层液体及其中的组织 浆膜层粘膜层34

11操作演示：0.1%胶原酶Ⅰ,37℃,30min;0.25%的胰蛋白酶,37℃,15-20min5768

12操作演示：终止消化，吹打，依次滤过100、200、400目的筛网，收集滤液，离心，铺板/瓶78910

13细胞鉴定：分化培养基(含2%小牛血清的培养基)中，卫星细胞早期（1-2d）则以梭形、纺锤形为主,相互之间以细丝拉网,随培养时间的延长，细胞增殖、相互融合并逐渐规律性地沿一个方向平行排列,并形成多核的肌管(3-4d)。早期卫星细胞（分化培养基处理2d）鉴定：Desmin（Green）、α-SMA（Red）均在胞浆中表达，有强有弱148、SD大鼠海马神经元细胞的