荧光定量PCR概述（操作篇 ）-江志辉.pptx

时间：2022年12月01日荧光定量PCR概述

1引物设计原则及操作2PrimerBlast核对引物特异性3细节操作问题建议4QPCR常见异常结果分析及处理建议CONTENTS目录操作篇

PART1引物设计原则及操作

引物设计原则及操作中洪博元生物丨科研服务领先一步什么是引物？引物的功能是什么？定义：是指在核苷酸聚合作用起始时合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢键形式连接。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补。（引物一般成对出现）功能：作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3开始合成新的核酸链。引物

引物设计原则及操作中洪博元生物丨科研服务领先一步引物设计原则首先引物与模板的序列要紧密互补。其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。最后引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。（1）上游或下游的碱基数控制在15-25nt。（2）上下游间碱基数相差不大。（3）上游或下游的Tm值控制在55-65℃。（目前实验室多选58-60℃）（4）上下游间Tm值相差尽量不超过1℃。（5）GC%控制在40-60%。（6）产物长度控制在100-300bp。（7）尽量减少二聚体、发卡结构等结构产生。（8）尽量避免错配产生。（9）上游或下游的3尽量避免是连续的A、G、C。（10）设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子（Exon）设计，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响，提高引物特异性。Tm值是指引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。

引物设计原则及操作中洪博元生物丨科研服务领先一步mRNA（编码RNA）基因引物设计：?方式一：选用Primer5设计正向粘贴（不变）反向粘贴正向互补反向互补

引物设计原则及操作中洪博元生物丨科研服务领先一步手动设计自动设计

引物设计原则及操作中洪博元生物丨科研服务领先一步自动设计（需要设置好一定条件）

引物设计原则及操作中洪博元生物丨科研服务领先一步1）Length：引物长度。2）Tm：退火温度。3）GC%：G和C碱基总占比。4）ProductLength：产物长度。5）Hairpin：发卡结构。6）Dimer：二聚体。7）Falsepriming：错配。8）CrossDimer：引物之间二聚体扩增。

引物设计原则及操作中洪博元生物丨科研服务领先一步F：5ATTTTGGAGGAGGGAACATC3

R：5GCCCAGCCTGCTTTCTTAT3正向（F）反向（R）

引物设计原则及操作中洪博元生物丨科研服务领先一步mRNA（编码RNA）基因引物设计：?方式二：选用PrimerBlast设计1）打开NCBI网址：/2）下拉找到PrimerBlast，点击进入。

引物设计原则及操作中洪博元生物丨科研服务领先一步引物设计页面共分为PCR模板、引物参数、外显子/内含子选择和特异性检测参数四个模块下面将对这四个模块中的设置进行详细讲解。PCR模板引物参数特异性检测参数外显子/内含子选择

引物设计原则及操作中洪博元生物丨科研服务领先一步输入基因登录号设定PCR引物的扩增产物长度范围，修改产物长度至100-300bp间适当修改最佳值（在最小值到最大值间），最小值，最大值和正反向引物Tm的最大差值。PCR模板引物参数

引物设计原则及操作中洪博元生物丨科研服务领先一步在抽提RNA的过程中，样本中的基因组DNA污染会显著影响最终的结果，虽然可以使用DNaseI进行处理将RNA样本中的中DNA降解掉，但是很难保证DNA降解完全。由于真核生物的基因组由内含子和外显子组成，而成熟的mRNA仅包含外显子而没有内含子，因此，在设计qPCR引物时，经常会选用跨外显子的方法进行设计，从而保证该引物不会对基因组DNA进行扩增。

引物设计原则及操作中洪博元生物丨科研服务领先一步对跨外显子无要求至少一条一定要跨外显子引物可以不跨外显子外显子引物在前后两个外显子的配对碱基数内含子长度外显子/内含子选择

引物设计原则及操作中洪博元生物丨科研服务领先一步特异性核对确保已打勾，默认打勾。特异性检测所用到的数据库一般选择Automatic即可，这样当用户输入的模板在比对的数据库中有很多相似的序列时（比如一段DNA序列在多个转录变体中都有），用户可以选择哪一些是需要检测的PCR模板。对于常用的检测基因表达上下调变化，此时PCR模板是mRNA的逆转录产物检测lncRNA，覆盖面更广模板是基因组选定生物体基因组选定对应物