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液相色谱方法建立:
样品制备:
??粉碎——提取浸膏——分段——点板——选择流动相
??粉碎——萃取——选择流动相
2.方法建立:
?选择流动相:1?查阅文献
???????2?研究目标物质性质:分子式、官能团
???????3?根据点板或萃取步骤的极性范围
???????4?根据经验(比如先用甲醇水尝试)
?选择色谱柱:1?柱长:一般柱子长相比于短,分离效果更好,但需要的时间将会延长。
??????2?填料粒径:粒径小相对于大,柱效更高,分离效果好,但压力相对高。
??????3?柱子种类:根据流动相或样品选择。
?选择检测器:根据样品选择检测器,常用紫外检测器。如:氨基酸类样品一般可选择蒸发光检测器,请参考文献。
?建立方法:1理论型:研究目标物质的分子性质、判断极性、查阅文献等根据以上研究结果,选择色谱条件后进行尝试经验型:查阅文献开始摸索方法(一般如果文献没有查到特别吻合的,我都是手里有什么柱子,比如C18,直接用甲醇水流动相,先走一下看看)。
?思路如下:
初始方法:选取C18色谱柱,甲醇和水做流动相(使用效果不好再换)梯度洗脱:95%水/5%甲醇——1h后——100%甲醇——所有峰出完为止。
?????2.根据出峰结果进行调整流动相比例(建议初始进样量小,浓度不易过高)如:色谱图中,在45-50min有几个重叠的峰,希望将此处分开。可计算45min和50min的流动相例45min处:95÷60×45=71.25,50min:95÷60×50=79.16调整流动比例:将45min-50分钟流动相比例梯度时间拉长
如调整为:
0-45min甲醇5%-70%
45-60min甲醇70%-80%
60-70min?甲醇80%-100%
直到所有峰出完为止,如达到分离目的,则继续优化,缩短方法时间,提高效率。如调整方法:将45min前和60min后,非目标物质所占用的时间缩短:0-10min甲醇5%-70%
10-25min甲醇70%-80%
25-30min甲醇80%-100%
????30-35min甲醇100%-100%
??根据结果继续优化,当优化到方法稳定,且效率高时,可尝试等度分离,因为等度分离方法相对更加稳定(根据经验,初始尝试条件,可根据梯度洗脱出峰时的浓度减去10%进行尝试,之后再进行调整)。
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