用偶联酶反应的最大瞬时速度测定靶酶活性的方法.pdf

用偶联酶反应的最大瞬时速度测定靶酶活性的方法

专利名称：用偶联酶反应的最大瞬时速度测定靶酶活性的方

法

技术领域：

本发明主要依据偶联酶反应达到稳态所需延迟时间效应，从

而用偶联酶反应的最大瞬时速度测定靶酶活性的方法，可用

于生物医药基础研究、临床检验、环境卫生监测等领域。

发明的

背景技术：

当所需要测定活性的酶所用底物和产物都难以直接测定时，

利用工具酶作用于对应的产物以便可用常规设备简便定量

产物生成的速度是一种实用方法，称为偶联酶法。常用的偶

联工具酶包括脱氢酶或其它生产显色产物的酶，以便通过脱

氢酶等对靶酶产物的作用，使得脱氢酶的指示底物或指示

产物NADH(NADPH)发生变化，这样可连续监测NADH或NADPH

吸收的变化推算待测靶酶的活性。偶联酶法中也可使用过氧

化物酶测定最终生成的有色产物，但其反应通常不便于连

续监测。偶联酶测定技术广泛应用于生物医药基础研究与临

床检验，例如偶联乳酸脱氢酶(LDH)测定谷丙转氨酶(ALT)

活性，偶联苹果酸脱氢酶(MDH)测定谷草转氨酶活性，同时

偶联葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶两种工具酶测定oc-

淀粉酶活性等。

根据经典初速度法分析偶联酶反应测定靶酶活性的基本理

论，为了使得工具酶作用于可直接测定物质造成的信号变

化速度与反应体系待测定靶酶反应初速度成正比，即偶联酶

反应体系达到稳态，所用工具酶的活性通常需要很高，才能

縮短偶联酶反应体系达到稳态所需要的时间，减少反应体系

达到稳态前指示底物的消耗而保障可测上限尽可能高。

使用单一工具酶时，通常所测靶酶活性线性上限不超过工具

酶最大活性的1%,使得工具酶的用量通常很大而成本很高

才能达到所需要的线性范围。当使用多个工具酶时，成本就

更明显。因此，如何降低工具酶的用量而保障甚至拓宽线性

范围，尤其是线性上限，对常规应用偶联酶技术测定靶酶

活性具有重要价值。

本发明依据偶联酶反应过程达到稳态所需延迟时间的现象，

提出分析全过程的瞬时速度，用最大瞬时速度表示靶酶活

性的方法，从而在相同工具酶用量下显著提高偶联酶活性测

定上限，或者降低工具酶用量和对应成本获得相同的线性范

围。

本发明所述的数据分析方法只适用于可连续监测反应过程

的偶联酶反应体系，可用于临床检验、生物医药的基础研究

等。

发明内容

本发明利用偶联酶反应过程达到稳态需要较长延迟时间的

现象，縮短连续监测反应过程的记录间隔或插值縮短被分

析数据的采样间隔，从而通过分析反应过程中的最大瞬时速

度确定待测靶酶的初速度(活性)，从而用相同量的工具酶显

著提高偶联酶反应体系可测靶酶活性的线性上限，或者显著

降低工具酶的用量和成本而同时保留相当的可测耙酶活性

的线性上限；其优势在工具酶米氏常数越高时越明显，使用

的工具酶越多则越明显。

分析模拟偶联酶反应数据发现，当原始数据中无离群值点时

偶联酶反应过程中瞬时速度先升后降，中间维持稳定，即反

应体系处于稳态而瞬时速度基本不变，故采用抛物线方程拟

合瞬时速度在稳态或接近稳态区间的变化趋势确定抛物线

顶点对应的最大瞬时速度。

本发明的核心是数据分析技术，除了要求被分析数据的采样

间隔较短外，其余可以与经典初速度法完全相同。但使用此

方法保障所需的线性范围后，工具酶的用量可优化减少。例

如，对于测定谷丙转氨酶则使用与经典初速度法完全相同的

实验条件以提高可测线性上限；对于测定谷草转氨酶时则

可降低工具酶用量也降低成本；对于偶联多个工具酶测定

OC-淀粉酶活性时则可使用完全相同的实验条件也显著提高

可测靶酶活性的线性上限。

本发明的代表性应用过程包括如下步骤

(1)按照与经典初速度法完全相同的条件准备偶联酶的反应

体系，或者自行设计偶联工具酶用量以降低工具酶成本；

(2)启动反应30s内以不长于30s间隔连续记录反应过程(附

图l和附图5);自动生化分析仪上逐个分析时可10S间隔采

样，平行分析可用30S或更长间隔；

(3)共连续监测3.0到5.0min内的反应过程数据；

(4)判断采样间隔是否符合要求，如果采样间隔不长于10s

则不需要进行插值处理，

如果长于19S则需要进行插值处理以缩短采样间隔；

(5)回归分析起点对应四个相邻数据点获得对应瞬时速度

(用Excel分析如附图2);

(6)依次对相邻四个数据点回归分析，判断回归分析的决定

系数是否符合要求，获得回归分析符合要求的反应过程瞬

时速度变化趋势图(附图3和附图6