基因工程医学知识讲座.pptx

基因工程医学知识讲座;二、基因工程中常见工具酶;限制性内切酶;限制性内切酶作用过程;DNA连接酶;DNA连接酶作用过程;基因工程载体;基因工程中常见载体;质粒特点;三、基因操作基础步骤;经典基因工程过程示意图;1、提取目标基因;将总DNA提取分离，然后用限制性内切酶将总DNA切开成为许多小片段，将这些基因组片段分别克隆在载体上，便组成该生物基因文库。普通用与目标基因个别序列互补并标识了放射性同位素一小段单链DNA作为探针对克隆基因文库进行杂交，互补结合需要基因片段，依据放射性同位素在胶片上感光原理，能够找到目标基因。这个方法通常称为印迹法。

工作量很大;印迹法;印迹法主要步骤：

（1）基因文库－DNA用限制性内切酶处理。

（2）DNA片断混合物经过电泳分离。

（3）电泳后，经过印迹技术转到酯酰纤维薄膜上，方便操作。

（4）用已知小片断DNA作为探针，互补结合需要找基因片断。

（5）探针DNA片断已用放射性元素标识，使胶片感光后可看出。;印迹法关键是“分子杂交”，利用碱基配正确标准，用一段小已知DNA片断去寻找大未知基因片断。

探针DNA片断从何而来？

依据目标蛋白氨基酸序列，只要其中N端15－20个氨基酸序列，按三联密码转为40-60核苷酸序列，人工合成，即为探针DNA片断。;（2）逆转录合成法

（假如所需要DNA片段很小）

以RNA为模版，逆转录合成互补DNA片段。

先将细胞核内基因组转录为RNA，以信使RNA（mRNA）为模板，在逆转录酶作用下依据碱基互补标准人工合成一段与之互补DNA片段，再以此单链DNA为模版，人工合成另外一条互补DNA子链，从而取得所需目标基因。

mRNA→单链DNA→双链DNA（cDNA）;（3）聚合酶链式反应（PCR）

（如目标基因核酸次序已知）

聚合酶链式反应（PCR）是多年来开发出来基因工程新技术，它最大优点是把目标基因寻找和扩增，放在一个步骤里完成。

反应在特制PCR仪中进行，需要DNA模版、引物、TaqDNA聚合酶、四种脱氧核苷酸。;基因克隆是指经过重组基因操作，把目标基因连接到载体上，在宿主细胞中增值，从而产生遗传物质和状态转移和重新组合。

克隆——生物分子，细胞,生物个体无性繁殖与复制过程都称为克隆。;2、结构重组DNA分子;目标基因与质粒连接;3、将目标基因导入受体细胞并扩增;4、目标基因检测;（2）Southern杂交

对于外源目标基因在转基因生物中情况检测好可采取放射性同位素标识核酸杂交法进行检测，也称为该法是利用毛细管作用使在凝胶电泳中分离DNA片段转移并结合在适当滤膜上，然后经过与已用同位素标识单链DNA探针杂交作用以检测这些被转移DNA片段。;（3）核苷酸测序法（自动检测分析）。

已知目标基因核苷酸序列可利用序列测定进行判定。

该方法是一个使用荧光染料无放射性标识DNA测序法。它使用4种不一样颜色荧光染料分别标识4种不一样碱基，并在一个凝胶电泳泳道中进行电泳，然后经过激光作用诱发荧光，到达检测碱基目标。激光检测器招搜集到信息传到电脑，计算机会自动显示或打印出碱基次序。一块凝胶36个泳道可测36×450约16200个碱基。以后又创造了一个用毛细管电泳代替凝胶电泳方法，可大大加紧电泳速度分辨率，并可实现自动灌胶和自动进样。;四、基因工程应用;重组人胰岛素

1982年世界第1个转基因产品

1000磅牛胰10克胰岛素

200升发酵液10克胰岛素

将与产人胰岛素相关两个基因片段（人工合成）转入大肠杆菌;（2）生产生物小分子

生产维生素C替换合成法。

提升氨基酸产量（将一些基因转入高产菌中）

（3）生产生物多聚体

生产黄原胶、生物合成橡胶、生产生物可降解塑料;（4）在生物农药上应用

经过基因改造大规模生产微生物杀虫剂、生物除草剂。

（5）在环境工程中应用

美国GE企业结构成功含有巨大烃类分解能力基因工程菌，并获专利，用于去除石油污染。;（6）转基因植物

抗病虫基因、抗除草剂基因、抗旱基因、抗病基因、抗寒基因、一些动物蛋白基因。

当前世界上大规模种植转基因作物有：

水稻、大豆、马铃薯、玉米、番茄、烟草、棉花、油菜、甜菜、向日葵、豌豆、辣椒、苜蓿、苹果、梨、兰花、玫瑰、康乃馨

在植物转基因中多采取农杆菌作为目标基因受体，再利用重组农杆菌感染植物细胞进行转化，将目标基因整合到植物基因中。;（7）转基因动物

转基因动物主要用于生产器官移植研究，生产对人类有价值产品，使动物含有一些可遗传抗性对付一些疾病与不良环境，当前出于对安全性考虑，禁止将转基因动物进入食品。