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热点专题13PCR技术及其应用[热点归纳]1.概念PCR是聚合酶链式反应的缩写,它是一项根据DNA半保留复制原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,迅速扩增DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在短时间内复制出上百万份的DNA。2.PCR的原理(1)DNA分子的热变性原理。当温度超过90℃时,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性。温度缓慢降低到50℃左右时,两条彼此分离的DNA链重新结合成双链,这个过程称为复性。DNA双链DNA单链(2)耐高温的DNA聚合酶。高温解决了打开双链的问题,但是,又导致DNA聚合酶失活的问题,耐高温的DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题,促成了PCR技术的自动化。(3)关于引物。①概念:引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度一般为20~30个核苷酸。②作用:使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸,见下图:(4)PCR(体外的DNA复制)的条件。①控制温度,但不需解旋酶。②DNA模板。③原料:dNTP,包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP,除提供原料外,还提供能量。④耐高温的DNA聚合酶。⑤分别与两条模板链相结合的两种引物。⑥需要在一定的缓冲液中进行。3.PCR的过程(1)一般情况下,DNA模板链较长,需要PCR扩增的基因只是DNA模板链的一段。(2)第一轮循环,两引物与模板链互补,DNA分子模板链最长,新合成的DNA单链(含有引物的链)较短。(3)第二轮循环,以含有引物的母链为模板合成的DNA分子,会出现含有引物的DNA,其中新合成的单链b会比母链量更短,其实b就是我们所需扩增的目的基因的长度,只是b为单链。(4)第三轮循环,以b为模板合成的DNA片段就是目的基因片段的长度。(5)结果分析。①两条单链等长DNA(目的基因)从第三轮循环开始出现(甲、乙)。随循环次数的增加,目的基因含量会不断增加。②通过以上分析可知,PCR反应的产物不都是所需的目的基因片段,除目的基因外,还会存在四种类型的DNA分子(这四种类型同第二轮循环产生的4个DNA分子)。③DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列,等长DNA(目的基因)从第三轮循环开始出现,随着循环次数的增多,呈指数扩增。4.PCR的应用现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序等。【典例】如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例):请据图回答问题。(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ主要存在于________生物中,限制酶存在于该类生物中的主要作用是________________________________________。(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3—羟基与5—磷酸间形成;PCR每次循环一般可分为(按顺序书写)三步,其中第二步的目的是。?原核切割外源DNA,保证自身安全磷酸二酯键变性、复性、延伸引物与两条模板DNA单链结合(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择,填编号)。项目DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列?PCR引物①5-AACTATGCGCTCATGA-3②5-AGAGGCTACGCATTGC-3③5-GCAATGCGTAGCCTCT-3④5-TCATGAGCGCATAGTT-3③④(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是。?A.5-AACTATGCG……AGCCCTT-3B.5-TTGATACGC……CGAGTAC-3C.5-GCAATGCGT……TCGGGAA-3D.5-AATTCCATG……CTGAATT-3D【解析】(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种限制酶,主要存在于原核生物中,它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,进而在特定部位将双链DNA切开,显然限制酶在原核生物中能切割外源DNA,保证自身安全。(2)步骤Ⅱ用的是DNA连接酶,DNA连接酶催化形成的是磷酸二酯键,即催化相邻核苷酸之间的3—羟基与5-磷酸间形成磷酸二酯键;PCR循环包括变性、复性和延伸三步,该过程
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