高考生物一轮复习第十四单元基因工程生物技术的安全性与伦理问题热点专题13PCR技术及其应用课件.ppt

热点专题13PCR技术及其应用［热点归纳］1.概念PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA。2.PCR的原理(1)DNA分子的热变性原理。当温度超过90℃时，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。温度缓慢降低到50℃左右时，两条彼此分离的DNA链重新结合成双链，这个过程称为复性。DNA双链DNA单链(2)耐高温的DNA聚合酶。高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。(3)关于引物。①概念：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度一般为20~30个核苷酸。②作用：使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸，见下图：(4)PCR(体外的DNA复制)的条件。①控制温度，但不需解旋酶。②DNA模板。③原料：dNTP，包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，除提供原料外，还提供能量。④耐高温的DNA聚合酶。⑤分别与两条模板链相结合的两种引物。⑥需要在一定的缓冲液中进行。3.PCR的过程(1)一般情况下，DNA模板链较长，需要PCR扩增的基因只是DNA模板链的一段。(2)第一轮循环，两引物与模板链互补，DNA分子模板链最长，新合成的DNA单链(含有引物的链)较短。(3)第二轮循环，以含有引物的母链为模板合成的DNA分子，会出现含有引物的DNA，其中新合成的单链b会比母链量更短，其实b就是我们所需扩增的目的基因的长度，只是b为单链。(4)第三轮循环，以b为模板合成的DNA片段就是目的基因片段的长度。(5)结果分析。①两条单链等长DNA(目的基因)从第三轮循环开始出现(甲、乙)。随循环次数的增加，目的基因含量会不断增加。②通过以上分析可知，PCR反应的产物不都是所需的目的基因片段，除目的基因外，还会存在四种类型的DNA分子(这四种类型同第二轮循环产生的4个DNA分子)。③DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，等长DNA(目的基因)从第三轮循环开始出现，随着循环次数的增多，呈指数扩增。4.PCR的应用现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序等。【典例】如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)：请据图回答问题。(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ主要存在于________生物中，限制酶存在于该类生物中的主要作用是________________________________________。(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3—羟基与5—磷酸间形成；PCR每次循环一般可分为(按顺序书写)三步，其中第二步的目的是。?原核切割外源DNA，保证自身安全磷酸二酯键变性、复性、延伸引物与两条模板DNA单链结合(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。项目DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列?PCR引物①5-AACTATGCGCTCATGA-3②5-AGAGGCTACGCATTGC-3③5-GCAATGCGTAGCCTCT-3④5-TCATGAGCGCATAGTT-3③④(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是。?A.5-AACTATGCG……AGCCCTT-3B.5-TTGATACGC……CGAGTAC-3C.5-GCAATGCGT……TCGGGAA-3D.5-AATTCCATG……CTGAATT-3D【解析】(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种限制酶，主要存在于原核生物中，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，进而在特定部位将双链DNA切开，显然限制酶在原核生物中能切割外源DNA，保证自身安全。(2)步骤Ⅱ用的是DNA连接酶，DNA连接酶催化形成的是磷酸二酯键，即催化相邻核苷酸之间的3—羟基与5-磷酸间形成磷酸二酯键；PCR循环包括变性、复性和延伸三步，该过程