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第三章抗体制备医学技术学院免疫教研室

教学目的l掌握：颗粒性抗原的制备、可溶性抗原的制备l熟悉：可溶性抗原的纯化--盐析法

第一节免疫原的制备免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物质。免疫原：颗粒性抗原可溶性抗原半抗原性免疫原

一、颗粒性抗原?细胞抗原：绵羊红细胞?细菌抗原：菌体抗原?鞭毛抗原?寄生虫体抗原：虫卵

血细胞抗原制备细菌抗原制备:多用液体或固体纯培养物，经集菌后处理。寄生虫和真菌抗原制备:除用破碎法加工粗提外，大多要加以适当纯化。

二、可溶性抗原（一）组织和细胞可溶性抗原的粗提?1.组织细胞抗原的制备：?高速捣碎法－组织捣碎机捣碎?研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨

组织和细胞成分混合抗原制备程序所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包膜或结洗去血迹及污物脏器进行灌洗缔组织NS内含0.5g／LNaN3装入捣碎机筒内高速粉碎制成组织匀浆液冷浴中组织剪碎3000r／上清液去除细胞碎片min×10min取上清液澄清及微小组织离心

2.细胞可溶性抗原的破碎?（1）超声破碎法?（2）酶处理法?（3）反复冻融法?（4）表面活性剂处理法

（1）超声破碎法原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎特点：①操作简单，重复性较好，节省时间②多用于微生物和组织细胞的破碎

（2）酶处理法常用酶类：溶菌酶（碱性环境）方法：EDTA--革兰氏阴性菌细胞壁特点：①此法适用多种微生物；②作用条件温和；③内含物成分不易受到破坏；④细胞壁损坏的程度可以控制。

（3）反复冻融法l原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。l方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后置室温融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。l特点：此法适用于组织细胞。

（4）表面活性剂处理法原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。应用:①破碎细菌，且作用比较温和②提取核酸时，常用此法破碎细胞

（二）可溶性抗原的提取和纯化1.超速离心法：?差速离心法－低速和高速交替进行?密度梯度离心法－区带离心法方法差速离心梯度密度离心

2.选择性沉淀法：核酸去除法－氯化锰、鱼精蛋白盐析法－硫酸铵、硫酸钠有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮聚合物沉淀法－聚乙二醇

盐析沉淀法原理：利用各种蛋白质在不同浓度的盐溶液中有不同的溶解度。优点：方便、有效、不影响蛋白质活性应用：抗原的初筛提取丙种球蛋白抗原的浓缩

水溶性非离子型聚合物沉淀法常用的聚合物：聚乙二醇(PEG)、硫酸葡聚糖应用：3%-4%PEG沉淀免疫复合物6%-7%PEG沉淀IgM8%-12%PEG沉淀IgG12%-15%PEG沉淀其他球蛋白25%PEG沉淀白蛋白

3.凝胶层析法样品溶液缓慢流经凝胶柱时，大分子短时间内被洗脱出来；小分子物质缓慢地流出分子筛柱；通过凝胶的分子筛作用,大、中、小三类分子彼此间较易分开。特点：简单易行，但掌握不好，分离效果较差。

白蛋白SephadexG-200凝胶

4.离子交换层析法原理：利用带电离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。

交联葡萄糖琼脂糖聚丙烯酰胺离子化细粉常用离子交换剂离子交换纤维素交联树脂

5.亲和层析法是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。特点：纯化效率高，速度快，有时仅一步即可达到纯化目的。

★亲和层析支持物的选择：①非特异性吸附低；②液体流速快；③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定；④有合适丰富的化学基团⑤有丰富的微，以增加结合容量。

★配体的选择条件：①抗原或抗体必须单一特异性；②抗原与抗体具有较高的亲和力；③配体必须有一个适当的化学基团。

★抗原或抗体与支持物的结合：①活化：溴化氰；②接“手臂”：带“手臂”琼脂糖有氨基琼脂糖、羧基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖、重氮盐衍生物琼脂糖、疏基琼脂糖。

★亲和层析条件的选择：①封闭活性基团②除去未结合和结合不牢的蛋白解脱剂：3mol/L硫氰酸钾（或钠）、0.1mol/LpH2.4甘氨酸缓冲液

★（三）免疫球蛋白片段的制备：1.解离二硫键2.溴化氰裂解法3.酶裂解法

三、半抗原半抗原（无免疫原性）多肽、多糖、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物以及＋载体完全抗原（具免疫原性）抗体/致敏淋巴细胞其他化学物品等。机体

1、载体的选择①蛋白质：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白②多肽聚合物：多聚赖氨酸③大分子聚合物：羧甲基纤维素聚乙烯吡咯烷酮

2、半抗原与载体的连接方法①物理方法②化学方法

碳化二亚胺法：混合