新技术在医学实验中的应用专家讲座.pptx

;内容提要;内容提要;Westernblot;Westernblot;;新技术在医学实验中的应用;Westernblot;示例试验步骤：

①蛋白质抽提

②蛋白浓度测定：

按试剂盒说明书，用BCA法测定蛋白浓度。

③变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)：

玻璃板夹槽中依次加入分离胶和浓缩胶，待其凝固；依据浓度取适量待测蛋白与5x上样缓冲液混匀后,95度变性10分钟,加入上样孔中，浸于电泳缓冲液，以75V（浓缩胶）及120V（分离胶）恒压电泳。

④转膜：

裁切与凝胶一样大小NC膜和滤纸，NC膜置于转膜缓冲液中浸泡30min以上。按次序依次放置滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，半干法以40mA恒流转膜2h。;;2D-Gel;免疫共沉淀;免疫共沉淀;Chromatinimmunoprecipitation（CHIP）;“猎枪”法（Shotgunproteomic）;免疫组化Immunohistochemistry;新技术在医学实验中的应用;

;免疫组化样本制备;免疫组化抗体使用;不一样探测方法;间接探测法介绍：PAP法;Avidin-BiotinComplex(ABC)法;LabeledStreptavidinBiotin(LSAB)法

;新技术在医学实验中的应用;免疫组化中注意关键点;流式细胞仪;流式细胞仪应用举例

细胞凋亡、死亡检测-AnnexinV/PI双染色法

1原理

细胞凋亡早期生化特征之一是氨基磷脂转移酶活性降低使磷脂酰丝氨酸(Phosphatdylserine)“翻到”细胞膜外层。荧光标识AnnexinV-FITC(AV)和碘化丙啶(propidumiodide,PI)双染可区分细胞凋亡和坏死,对AV和PI均不染色是正常细胞,对AV染色对PI不染色为早期凋亡细胞,对AV和PI均染色为晚期凋亡细胞或坏死细胞。

2结果判断

凋亡细胞对全部用于细胞活性判定染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤细胞DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好细胞则不会有红色荧光产生。所以，在细胞凋亡早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相同。在双变量流式细胞仪散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。

;;[Ca2+]i检测－Fluo-3-AM荧光染色

原理

用荧光探针Fluo-3-AM进入细胞后经非特异性酯酶水解为Fluo-3,后者是钙离子螯合剂,与钙离子形成复合物经紫外激发可产生荧光,流式细胞仪经过检测其荧光强度??间接反应胞内游离钙水平。

;线粒体膜电位（ΔψМ）测定－rhodanmine123荧光染色

原理

氧化刺激诱导细胞凋亡可致线粒体两种功效改变:一是线粒体膜电位降低和线粒体通透性孔开放,二是线粒体产生活性氧。线粒体对rhodanmine123摄取依赖其膜电位,分析rhodanmine123荧光强度可反应线粒体膜电位。;激光扫描共聚焦显微(ConfocalLaserScanningMicroscopy，CLSM）

;②激光共聚焦显微镜普通都有2个以上不一样波长激光管，所以只要将标本标识上不一样波长荧光，就能够在同一张切片上同时分析2种或更多不一样指标改变，并比较它们之间比值改变，方便而准确。

③激光共聚焦显微镜能够依据科研需要，提供纯荧光、白光、以及荧光与白光合成图像等各种图像。

④以往免疫荧光染色多要求冰冻新鲜组织标本，如用石蜡切片做免疫荧光染色，在普通荧光显微镜下观察，常因背景非特异性荧光过强而影响观察结果。但如用激光共聚焦显微镜扫描石蜡切片荧光染色，可取得清楚图像。

;3应用

㈠定性定量定位荧光分析:

CLSM可对单、双或三色标识细胞及组织标本荧光进行定性定量定位分析，还可测定膜电位和配体结合等生化反应程度。

㈡Ca2和pH等细胞内离子实时定量测定:

利用Fluo-3、Fura2等荧光探针，CLSM能够测定Ca2在活细胞内浓度改变。CLSM可测定单个或一群细胞内ca2浓度，并提供细胞内Ca2分布二维及至三维图像。另外，假如对细胞施加外部刺激，CLSM就能观察到细胞内各点Ca2浓度在外部刺激下随时间而产生改变。这对于研究Ca2等离子细胞内动力学有意义。利用SNAFL类探针可对单个或一群细胞内pH及细胞内pH改变进行测定。使用双荧光探针Fluo一3和CNARF可进行Ca2和pH同时测定。

㈢细胞物理化学动态监测：

CLSM可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度及细胞内颗粒数等参数进行自动测定，能对细胞溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白质、DNA、RNA、酶和受体分子等细