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猪生长抑素（SS）RNAi效应的假型慢病毒制备

【摘要】生长抑素(SST)是抑制动物生长的主要因子。SST主动免疫和添加SST抑制剂对提高动物生长取得了一定的效果但仍不理想，而传统的育种方法在改善动物的生长性能方面进程非常缓慢，因而探索探索新的方法和技术十分必要。RNAi是下调靶基因的有效方法，慢病毒载体也是目前应用前景最广泛的基因转移载体。本研究根据靶基因SST设计和筛选出了最优RNAi效应的靶基因-shRNA序列，通过RIA检测转染细胞裂解液中SS浓度，结果表明SS-shRNA产生的siRNA对SST基因表达抑制率为863-879%。并已成功将SS-shRNA序列构建到慢病毒载体上，利用慢病毒四质粒系统成功包装出假病毒颗粒，经测定病毒原液的滴度达到5×104ifu/ml，超速离心后病毒滴度为5×109ifu/ml，该病毒滴度完全满足慢病毒介导转基因动物的制备的需要。本研究为下一步慢病毒载体与动物生殖细胞联合介导制备靶基因-shRNA表达的转基因动物，通过RNAi效应在动物整体水平上下调SST的表达，提高动物生产性能提供了前期实验基础。

【关键词】生长抑素RNAi效应假型慢病毒

【正文】

1引言

11生长抑素在动物促生长领域的应用

动物生长的过程受很多激素调节，其中生长激素（GH，GrowthHormone）是调节动物生长的核心之一。GH的水平影响骨软骨的生长以及肌蛋白的合成与沉积等，从而影响动物和人的生长状况。在生产应用上GH具有促生长，提高瘦肉率抑制脂肪合成以及提高饲料转化率等方面的作用，有着广泛的经济价值和社会效益。生长抑素（SS）通过抑制垂体分泌GH，从而降低GH水平。目前在生产上采取降低SS水平，解除SS对GHIGF－I等的抑制，达到促进动物生长的目的，如主动免疫技术。随着胚胎技术和转基因技术的发展，在动物整体水平上敲除或沉默目的基因或导入外源基因改良动物的生产性能已得到了广泛的研究与应用。一种比较好的研究思路和策略就是在整体水平上敲除或沉默SS基因或降低表达水平可长久性可遗传性获得低SS水平的转基因动物。

12慢病毒载体与RNAi技术联合介导转基因动物

目前制约转基因动物产业化的瓶颈问题主要表现在转基因成本高效率低外源基因表达量不高以及遗传性状不稳定等方面。在已建立的转基因方法中，比较成熟的有显微注射法和体细胞克隆法，目前多种转基因动物是通过这两种方法获得的。

DNA显微注射法是最早出现的一种转基因方法，该方法需要严格的显微操作技术，制作成本高（6-30万美元）效率低（1%）等特点，比较难以大众化推广应用。体细胞核移植法是目前认为效率较高应用广泛的一种转基因方法。该法在连续的胚胎克隆会积累后成遗传的错误，降低了克隆的效率。因此通过克隆方法增加个体后代比较困难。虽然该法转基因率100%，但由于克隆胚胎的制备成功率为005-12%，因而整个转基因效率跟显微注射法差不多。此外，胚胎干细胞法目前在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚，还不成熟。

其他几种方法相对操作简单成本低，但还没有成熟。如逆转录病毒载体介导法精子介导基因转移法以及睾丸介导基因转移法等均存在外源基因整合效率差的问题。

寻找和探索高效经济便捷的转基因的新技术和新方法有着重要的意义和紧迫性。

慢病毒（lentivirus，LV）载体法是近年来发展起来的一种有效的基因转移载体。由于其高整合和高表达效应低成本和操作简单等优点有望成为一种应用广泛的新型基因转移载体。目前利用慢病毒载体在许多动物上获得了成功，如小鼠大鼠牛猪羊等。与其它逆转录病毒载体法相比，慢病毒不仅可以感染静止细胞，还能感染分裂细胞，极大地提高了感染力；同时研究表明将慢病毒载体LTRs内增强子和启动子用通用或组织特异性启动子取代，转基因猪生产效率可达到31%，表达效率达90%以上，表明除了高的感染力很高的整合效率和表达效率，同时成本大约是显微注射法的十分之一。很有希望发展成为简捷高效低成本的转基因技术。但是目前慢病毒载体介导的基因转移方法在安全性甲基化沉默和定点整合方面还有待于进一步改进。若将慢病毒载体与上述转基因技术联合应用对寻找和探索高效经济便捷的转基因的新技术和新方法有着重要的意义。

过去转基因的目的主要通过两种途径，一是直接转入外源基因过量表达，如生物反应器；二是同源重组敲除（knock-out）靶基因，如疾病动物模型和器官移植，但完全敲除某个功能基因，在有些情况下可能会引发了一系列新的机能紊乱。将目标基因的功能只是部分调控（knockdown），在改变动物的某些重要性状方面将会有重要的作用。近年来一系列研究表明，动物的生长发育是由一系列复杂多层次的基因表达网络所调控。与基因敲除相比，将靶基因的功能只是部分下调，既可以维持动物生长发育调控网络整体性，又