植物过氧化物酶同工酶测定ct专家讲座.pptx

1试验08植物过氧化物酶同工酶测定

（园盘式凝胶电泳法）一、原理聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合而成，含有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调整。凝胶电泳兼有电荷效应和分子筛效应。被分离物质因为所载电荷数量、分子大小和形状差异，在电泳时会产生不一样泳动速率而相互分离。植物过氧化物酶同工酶测定ct专家讲座第1页

2过氧化物酶是植物体内常见氧化酶，植物体内许多生理代谢过程受其同工酶种类及活性调整。同工酶含有不一样迁移速度。将电泳后凝胶置于含有H2O2及联苯胺溶液中染色，利用过氧化物酶催化H2O2分解并把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物原理，出现蓝色或棕褐色条带即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在位置，多条有色带即组成过氧化物酶同工酶酶谱。

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3二、材料、设备与试剂（一）试验材料：小麦芽。（二）设备：1.冷冻离心机；2.稳流稳压电泳仪；3.电泳槽（园盘型）等。（三）试剂1.分离胶缓冲液2.分离胶贮液：3.过硫酸铵：现配现用。植物过氧化物酶同工酶测定ct专家讲座第3页

44.四甲基乙二胺(TEMED)。5.电极缓冲液：Tris6.0g，Gly（甘氨酸）28.8g，用水定容至1000mL(pH8.3)，用前稀释10倍。6.3%H2O2。7.联苯胺染色母液：联苯胺1g+冰醋酸18mL+H2O2mL溶解后贮于棕色瓶中。8.同工酶染色液：配后马上使用。取0.5mL联苯胺母液+9.3mLH2O+0.2mL3%H2O2。植物过氧化物酶同工酶测定ct专家讲座第4页

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三、试验步骤

（一）过氧化物酶提取（二）电泳槽安装（三）分离胶配制先准备约6支干燥、洁净玻璃管，将下端用堵头封闭，防于试管架上备用。按分离胶缓冲液∶分离胶贮液∶H2O∶过硫酸铵溶液=1.5mL∶3mL∶1.5mL∶6mL百分比吸收各溶液至小烧杯中，然后加入一滴四甲基乙二胺（TEMED），混合均匀，用尖嘴滴管灌吸收混合好胶液并灌注到玻璃管中，直至胶液至玻管刻度线处(如有气泡应设法排除)，然后沿玻管内壁在胶面上迟缓加注0.5cm水层，约30min左右，当见到水层底下有一清楚界面时，表明胶已聚合。倒去水层，或用滤纸条吸干水分。（四）点样（五）电泳植物过氧化物酶同工酶测定ct专家讲座第5页

6（六）剥胶电泳完成，将电泳槽取出，倒去缓冲液，取下凝胶管，放入培养皿中。用一个带有长针头注射器，吸满水，将针头沿管壁插入，同时慢慢地将注射器中水推出，并不停转动凝胶管，将凝胶管挤脱出来。（七）染色取0.5mL联苯胺母液+9.3mLH2O+0.2mL3%H2O2，混匀后倒入盛有凝胶条培养皿。此时能够看到胶条上出现蓝色或棕褐色环，即过氧化物酶酶带，约10min后用自来水冲洗，此时蓝色带会慢慢变为棕褐色条带。植物过氧化物酶同工酶测定ct专家讲座第6页

7四、结果用尺子量出各酶带和溴酚蓝迁移距离，计算各同工酶迁移率，并划出同工酶图谱。植物过氧化物酶同工酶测定ct专家讲座第7页

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