FISH荧光原位杂交操作说明.docx

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简便、快捷、准确－临床诊断中的FISH检测

FISH〔即荧光原位杂交〕技

术作为分子诊断的重要工具，在科研和临床诊断领域都有着广泛的应用。FISH检测是利用荧光基团标记DNA探针，再将标记的DNA探针与样本DNA进展原位杂交，最终在荧光显微镜下对荧光信号进展计数，以此作为诊断的依据。FISH的操作简便快捷，结果直观准确，因此FISH成了很多疾病诊断的首选工具。下面我们将从探针的设计，样本的制备，原位杂交和检测结果的观看等几个方面简洁介绍FISH的操作。

探针是FISH检测灵敏度和准确性的关键。FISH检测的准确性来源于探针的设计。FISH能否应用于某一领域也取决于是否具有相应的探针。用于FISH检测的探针必需具备很高的特异性，能特异性地识别特定的基因或染色体上特定的片断。而且FISH的探针必需能经受原位杂交的处理而不变性。荧光基团的标记也直接影响了检测的灵敏度和原位杂交结

室温，降低探针的粘度，使用适宜的移液管

探针的预备1.让探针加热至振荡混合。用微型离心机将内容物离心〔1-3秒

探针的预备

1.让探

针加热至

留意：该探针已经经过变性可直接与样本片子反响。假设探针是非降解型，需进展73℃5分钟的变性

杂交

杂交

在片子上，将10μL的CEP18/X/Y混合探针加到一个反响区，将10μ的LLSI13/21混合探针加至另一个反响区。将22mm×22mm的盖玻片马上掩盖反响区，使探针溶液布满整个掩盖区。气泡会干扰杂交，因此必需排解气泡

果的检测方式。以著名的探针生产商Vysis公司的LSI系列探针为例：LSI系列探针来源于BAC大片断基因组文库，探针所掩盖的染色体片断总长可达100Kb－400Kb，保证了探针的高特异性和极强的荧光信号；荧光基团承受直接标记法标记，不同波长的荧光基团使探针在荧光显微镜下呈现多种荧光信号，借此我们可以一次检测多个染色体或基因的特别；由于探针具有极强的荧光信号因而对FISH结果的检测也承受直接检测法，即在荧光显微镜下直接观看FISH的信号，而无需抗原－抗体反响对荧光信号进展放大。Vysis探针的设计既确保了探针的特异性和灵敏度，同时直接的镜检也使FISH检测更简便。

FISH检测对被测样本没有特别的要求。可以是来自骨髓的细胞，也可以是来自羊水的细胞；可以是冰冻切片的样本，也可以是经过石蜡包埋的样本。甚至可以利用尿液样本进展膀胱癌复发的预后。猎取的样本细胞也无需经过培育扩增，FISH检测可以显示单个细胞核内染色体的特别状况。

留意：在盖玻片掩盖前，不

能在多目标区加探针溶液；盖玻片应37℃预热

用树胶封片：用5ml的注射器吸去树胶，在盖玻片的四周加上树胶

将封好的片子放入37℃预热的杂交盒中，盖紧盖子，37℃孵育6-24小时

杂交后的冲洗

杂交后的冲洗

在科普林染色缸中参加0.4×SSC/0.3%NP-40。将染色缸放入73±1℃的水浴中半小时以上，使0.4×SSC/0.3%NP-40溶液的温度到达73±1℃。每批使用前都必需确保0.4×SSC/0.3%NP-40溶液的温度到达73±1℃

在科普林染色缸中参加2×SSC/0.1%NP-40，放置至室温。两种洗液使用过一天后就应丢弃

我们以Vysis公司的AneuVysion多色DNA探针试剂盒为例，简要介绍FISH的原位杂交过程。AneuVysion多色DNA探针试剂盒用于羊水细胞的产前诊断，样本是来源于羊水的细胞。试剂盒通过两组5种探针〔LSI13/21和CEP18/X/Y〕同时检测5个染色体的数目特别，以此为依据进展产前诊断。

样本的制备

样本的制备

1000转/分别心羊水〔AF〕5分钟。羊水应没有血色或褐色。

用2-5ml的1×胰酶/EDTA溶液〔0.05%胰酶，0.53MEDTA4Na的Hank氏平衡盐溶液，不含CaCl2、MgCl2.6H2O、MgSO4.7H2O〕悬浮沉淀，37℃水浴15分钟以上

1000转/分别心5分钟

用2-5ml的0.56%KCl溶液悬浮细胞，37℃水浴20分钟。这些处理步骤的目的是使羊水细胞成为悬浮的单细胞。

挪去树胶和盖玻片，将片子马上放入73±1℃装有0.4×SSC/0.3%NP-40的科普林染色缸中，漂洗3秒左右。其他片子同样操作，然后孵育2分钟。不要同时操作4片以上。假设操作4片以上，取保0.4×SSC/0.3%NP-40的温度在73±1℃

留意：在洗浴前不能揭去盖玻片。当最终一片进入洗液后，开头计时2分钟

将片子放入装