(1.23)--实验3 硝酸还原酶活力测定.ppt

实验三

硝酸还原酶活力的测定一、原理硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在520nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以Nμg·g﹣1·h﹣1为单位。分光光度计；真空抽气泵（或20ml注射器筒）；天平；单面刀片；保温箱（或恒温水浴）；刻度试管（15ml）；移液管（5ml×2，2ml×8，1ml×2）；小青菜三、试验试剂亚硝酸钠标准液：称取分析纯NaNO20.1000g水溶后定容至100ml，吸取5ml用水稀释定容至1000ml，即为每ml含NaNO25μg的标准液。0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液：K2HPO419.24g，KH2PO42.2g，加水溶解后定容至1000ml。三、试验试剂1%（W/V）对-氨基苯磺酸溶液：称取1.0g加入25ml浓HCl中，用蒸馏水定容至100ml。0.2%（W/V）α-萘胺溶液：称取0.2gα-萘胺溶于25ml冰醋酸中，用蒸馏水定容至100ml。30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。KNO3溶液：0.2mol/L。四、实验步骤1.标准曲线制作：吸取不同浓度的NaNO2（0、1、2、3、4、5μg/ml）溶液各1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml和α-萘胺试剂2ml，摇匀后静置或恒温水浴中保温30min，然后在520nm波长下比色。以亚硝态氮（μg）为横坐标，光密度值为纵坐标绘标准曲线或建立回归方程。2．酶反应和酶活性测定（1）取样将材料洗净，滤纸吸干。在叶片中部打取直径0.5cm的圆片30个，混匀后放入50ml三角烧瓶中。（2）反应向三角烧瓶中加入KNO35ml+磷酸缓冲液5ml，向另一三角烧瓶中加入蒸馏水5ml+磷酸缓冲液5ml作对照。然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气，反复几次直至叶片沉在管底。将三角烧瓶置30℃下恒温水浴保温30min，分别取1ml同标准曲线法测定。（3）计算酶活性**---------活体法二、设备与材料五、注意事项及思考1、硝酸还原酶为诱导酶，在实验前最好用硝酸盐进行喷洒；2、试比较取样前处于光照或黑暗条件下酶活性有何不同？3、试比较活体法和离体法的优缺点。***