(1.24)--实验4 叶绿体色素的提取和分离和含量测定.ppt

实验四叶绿体色素的提取分离

及其性质的测定

实验五叶绿素a、b含量测定实验目的了解叶绿素提取分离的原理以及它们的光学特性在光合作用中的意义。掌握测定叶绿素a、b含量的方法。实验原理叶绿体色素是植物吸收太阳能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素组成，根据它们在有机溶剂中的溶解度不同以及在吸附剂上的吸附能力不同，将它们彼此分开。叶绿素和类胡萝卜素都有光学活性，表现出一定的吸收光谱可用分光光度镜检查或用分光光度计精确测定（OD值）。实验材料和仪器实验仪器：大试管，台天平，研钵，量筒，烧杯，漏斗，滤纸，毛细滴管，剪刀，分光光度计，培养皿、盖玻片。实验试剂：丙酮，甲醇，醋酸酮，盐酸，氢氧化钾，石英砂，碳酸钙，无水硫酸钠，四氯化碳。实验材料：新鲜植物叶片（菠菜、油冬菜）。实验步骤叶绿色素的提取称取新鲜菠菜叶片2克，去脉，放入研钵中加丙酮5ml，少许碳酸钙和石英沙，研磨或匀浆，再加入丙酮10ml，以漏斗过滤之，即为色素提取叶液。放入暗处备用。观察叶绿体色素的荧光反映现象取上述色素丙酮提取液少许于试管中，分别观察在反射光和投射光一侧，提取液的颜色有无不同。反射光侧观察到的血红色，即为叶绿素产生的荧光颜色。铜代反映取色素丙酮提取液少许于试管中一滴一滴加浓盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去Mg叶绿素，然后加醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液，则会产生鲜亮的绿色，此时形成了铜代叶绿素。点样展层，分离叶绿体色素准备：取宽约1cm，长约10cm的长方形滤纸条，将一端剪成梯形，另一端固定于橡皮塞上。点样：用毛细吸管吸取或盖玻片蘸取叶绿体色素提取液，滴在滤纸梯形上端。每一次提取液干了，再滴下一次。分离：于大试管中倒入适量展开液，将滤纸条放入大试管中，底端必须与展开剂相接触。观察色素分离现象。叶绿素含量的测定取1ml上述提取液，以80%丙酮稀释20倍。然后一80%丙酮为对照，分别测定663nm，645nm处的光密度值。按相关公式分别计算色素提取液中的叶绿素a，叶绿素b的含量。再根据稀释倍数分别计算每克叶片中色素的含量。实验结果荧光现象在投射光一侧观察到提取液的颜色为绿色，而在反色光一侧则观察到血红铜代反应在加入数滴浓盐酸后，提取液呈褐色；后加入醋酸铜晶体，加热观察到了鲜亮的绿色。叶绿素含量测定测定结果：OD645=0.266OD663=0.591Ca=12.7OD663-2.69OD645得Ca=6.79mg/lCb=22.9OD645-4.68OD663得Cb=3.33mg/lCT=Ca+Cb=10.12mg/l所以1ml提取液中的叶绿素含量Nt=CT*V*稀释倍数＝10.12mg/l*1ml*20=0.202mg其中叶绿素a含量na=6.79*1*20=0.136mg叶绿素bNb=0.66mg所以每克鲜叶片中,叶绿素a的含量为1.02mg/g叶绿素b的含量为0.495mg/g所以叶绿素含量为：1.516mg/g注意事项称取的新鲜绿叶,尽量去除叶脉,满足2克叶绿体中有充分的叶绿素.研磨时要加入CaCO3,因为它能调节液体的,防止叶绿素被破坏.研磨时要注意加入石英砂,因为这样可充分研磨破坏叶表皮,色素能被充分提取.分离叶绿素时,点样的纸卷不宜过细,两端要平整,保证叶绿素扩展速度均匀等;保证色素扩展清晰,应多点样几次,大约20次左右.***