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Lac16调控自噬通路发挥CP梭菌感染鸡胚肠上皮细胞培养流程
培养基准备：F12培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、双抗（青霉素-链霉素）、胰蛋白酶（EDTA溶液）、DMEM-F12培养液(DMEM:FBS:双抗=44.5ml:5ml:0.5ml)
试验设计：
将分离、培养好的鸡胚肠上皮细胞试验分为4处理组：空白对照组、Lac16组、Cp组、Lac16+Cp组。
步骤如下：
鸡胚肠上皮细胞IEC
1.细胞复苏；取出冻存的细胞，在37度水浴下溶解（慢冻速溶；-20、-40、-80梯度冻存，37℃溶解）。
2.细胞培养；在培养皿中加入6-8mlDMEM-F12培养液,加入IEC细胞，并将培养血放入5%CO2，37℃培养箱中培养10小时左右，观察细胞状态，待细胞长满培养皿70-80%时进行铺板培养。
3.铺板；吸取培养皿中的培养基，加入EDTA进行消化吹打（不宜消化太久），后加入1-2mlDMEM-F12培养液终止消化，3000?rpm离心5分钟（可视细胞状态调节）。后将混合液加入平均分到12孔板中，再加入DMEM-F12培养液（加至孔高度一半的培养液），轻轻摇晃12孔板使溶液分布均匀，将12孔板置于5%CO2，37℃培养箱中培养。
4.处理：待每孔的细胞长满至80%左右时，取出后按图所示加入lac16和CP进行共培养。细菌培养：Lac16培养14小时后，OD600为0.70~0.85,细菌的浓度为107CFU/ml左右。CP培养6小时左右得到106CFU/mlCP。轻轻摇晃培养使溶液分布均匀，将12孔板放入5%CO2,浓度的37℃培养箱中培养。
按下图所示：CON:正常培养基培养。CP：106CFU/mlCp处理1h。Lac16:107CFU/ml益生菌Lac16处理6h。Lac16+CP：107CFU/ml益生菌Lac16预处理6h，106CFU/mlCP处理1h。
检测指标：
制备透射电镜的样品；利用透射电镜观察自噬小体结构
qPCR，WB;提取细胞RNA、蛋白；检测自噬相关基因（ATG5、ATG12、ATG16L1）的表达
LDH检测细胞损伤；利用LDH检测试剂盒检测
细胞活性实验；
细胞上清炎症因子检测；细胞炎症因子表达
流式细胞术检测细胞凋亡；试剂盒
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