RNA提取一般步骤总结.docx

RNA提取一般步骤总结

rna提取原理：

|用变性剂破坏细胞或组织，然后用氯仿和其他有机溶剂提取RNA，沉淀、洗涤、枯燥，最终溶解。然而，RNA酶无处不在，随时都可能降解RNA，因此在试验中有很多地方需要

留意，假设无视它们，之前的努力就会白费。RNA提取的一般步骤

全部rna的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效裂开；有效地使核蛋白复合体变性；对内源rna酶的有效抑制；有效地将rna从dna和蛋白混合物中分别；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制rna酶活性。rna的提取目前阶段主要可承受两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将rna沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下dna与蛋白质进入有机相而rna留在水相。第一种提取方法将导致小分子量rna的丧失，目前该方法的使用频率已很低。试验步骤：

组织裂开→RNA分别→RNA沉淀→RNA洗涤→RNA溶化→RNA保存。

1、裂开组织和灭活rna酶可以同步进展，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、np-40、sds、蛋白酶k等裂开组织，参加β-me可以抑制rna酶活性。

2.RNA一般用苯酚、氯仿等有机溶剂和少量异戊醇分别。经过这个步骤和离心，RNA通常分布在上层，并从蛋白质层分别。

3、沉淀rna一般用乙醇、3mnaac〔ph-5.2〕或异丙醇。

4.用70%乙醇清洗RNA。有时，这一步可以省略，以避开RNA被洗掉。洗涤后，可在空气中枯燥或用乙醇枯燥，但不能太干，否则不易溶解。5.Te通常用于溶解RNA。

6、保存rna应当尽量低温。为了防止痕量rnase的污染，从富含rnase的样品〔如胰脏、肝脏〕中分别到的rna需要贮存在甲醛中以保存高质量的rna，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的rna，在水中贮存一个星期就根本降解了，而从大鼠脾脏中提取的rna，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量rnase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存rna样品的稳定性，可以将rna溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存rna的甲酰胺肯定不能含有降解rna的杂物。来源于胰脏的rna至少可以在甲酰胺中保存一年。当预备使用rna时，可以使用以下方法沉淀rna：参加naac至0.3m，12,000×g离心5分钟。i氯化锂法提取总rna：

该方法使用高浓度尿素变性蛋白质并抑制核糖核酸酶，使用氯化锂选择性沉淀RNA。特别适用于从大量样本中提取少量组织RNA。它具有快速、简便的优点，但也存在DNA污染小、RNA产量低、小RNA片段丧失等缺点。测试试剂：

1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3m)尿素、360g(6m)加水至1l，过滤灭菌】2、悬浮液【10mm?tris-hcl(ph7.6),1mm?edta(ph8,0),0.5%sds】试验步骤：

1.对于大量组织或细胞，每克组织或细胞参加5-10ml氯化锂尿素溶液，匀浆器高速匀浆2分钟；对于少量细胞〔107个细胞/ml〕，向每克组织或细胞中添加0.5ml氯化锂尿素溶液，手动混合，并将其转移到Ependof管中。

2、匀桨液在0－4℃放置4小时后，12023g离心30分钟。

3.取沉淀，参加原均化液的1/2体积氯化锂尿素溶液，重复步骤2。

4、沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂－尿素溶液复溶后，参加等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15－30分钟并不时摇动混匀，4000g离心5分钟。

5.取上层水相，参加1/10倍体积的3M醋酸钠〔ph5.2〕和2倍体积的乙醇，在-20℃下放置1小时，离心5000g。

6、70％乙醇洗沉淀一次。真空枯燥。

7.通过将沉淀溶解在RNA溶解溶液中获得RNA。RNA被重包装并储存在-70℃下。蛋白酶-热酚法

本方法适合于病毒rna的提取试验试剂：

1.蛋白酶K〔最终浓度50ug/ml〕，j5pl6v/T7[/I

2、2×缓冲液：1%sds?20mmtris-hcl(ph7.6)?0.2mnacl试验步骤：

1.向纯化的病毒溶液中参加等体积缓冲液和蛋白酶K，37℃40-50分钟。

2、参加等体积65℃预热的酚溶液，轻徭,在65℃保温5分钟后再轻徭。离心，取上清，氯仿抽提一次。

4.取上层水相，参加1/10倍体积的3M醋酸钠〔ph5.2〕和2倍体积的乙醇，在-20℃下放置1小时，离心5000g〔10000g，10min〕。

70％乙醇洗沉淀一次。真空枯燥。

6.将沉淀溶解在RNA溶解溶液中，获得RNA。RNA被重包装并储