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蛋白印迹实验报告

篇一：实验十二Western印迹鉴定

目标蛋白

实验十二Western印迹鉴定目标蛋

白

实验目的

1.了解Westernblot的原理及其意

义，掌握Westernblot的操作方法；

2.应用Westernblot技术分析鉴定

经SDS分离后转移到尼龙膜上的

重组蛋白。

实验原理

Western印迹法简称蛋白质印迹法。

蛋白质样品经SDS电泳后，凝胶

所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转

移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维

素膜）上，固相载体以非共价键的形式

与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以

膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第

一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位

1

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素标记的第二抗体反应，用适当的溶液

漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液

中温育，或通过放射自显影显出谱带，

即可检测出样品中的特异蛋白组分。

试剂与器材

试剂

1.转移缓冲液：甘氨酸（39

mmol/L），Tris碱（48mmol/L），SDS

（%），200ml甲醇（20%），定容至

1,000mL；

2.封闭液：5%脱脂奶粉，%叠氮

钠，溶于PBST溶液中；

3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽

春红S溶于1mL冰乙酸中，加水至

100mL；

洗膜液：PBS缓冲液含%Tween

20；

5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB

（二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底

物之一，临用前稀释。

6．5xPBS：在1600mL蒸馏水中溶

解Na2HPO4,NaH2PO4,40gNaCl,

2

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用/LNaOH调pH至，加水定容至2升。

高压灭菌20分钟，室温保存。用前稀释

至1x。

7．SDS电泳用溶液和试剂。

器材

电泳装置一套;

2.电转移膜装置

3.抗体-酶反应摇床

操作方法

〈一〉电转移

1．将蛋白质样品进行SDS，

待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。

2．载手套切6-8张定性滤纸和一张

尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相

同。在尼龙膜的一（左）角作一记号（或

剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于

转移缓冲液中。

3．剥胶，并将凝胶裁成合适大小，

切角以做记号（2）。

4．按下图示制备“夹心饼”，打开电

极板，在一边放上一块纤维垫，再依次

往上叠加3-4张滤纸，将凝胶轻放于滤

3

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纸上。再将一张NC膜放上，加上3-4

张滤纸，每加上一种物品都要精确对齐，

并确保没有气泡。再铺上纤维垫，最后

将电极板夹上，夹上夹子插进转膜槽中。

5．按下示意图，接上电源（凝胶一

边接负极，尼龙膜一边接正极），恒流电

泳小时，/cm2膜。

6．关闭电源，将尼龙膜取出，置塑

料