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RNAi试验原理与方法

近年来的争论说明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被称为RNA干扰〔RNAi〕。

一、RNAi的分子机制

通过生化和遗传学争论说明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititationandeffectorsteps)。在起始阶段，参加的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNAs)。证据说明；一个称为Dicer的酶，是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依靠的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。

在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物〔RNA-inducedsilencingcomplex,RISC〕。激活RISC需要一个ATP依靠的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的精准机制尚不明白，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。

另外，还有争论证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.

二、如何进展RNAi试验

(一)siRNA的设计

在设计RNAi试验时，可以先在以下网站进展目标序列的筛选：“://genesil/business/products/order2.htm“://genesil/business/products/order2.htm“://ambion/techlib/misc/siRNA_finder.html“://ambion/techlib/misc/siRNA_finder.html“:///Stu/shilin/rnai.html“:///Stu/shilin/rnai.html“://design.dharmacon/rnadesign/default.aspx?SID://design.dharmacon/rnadesign/default.aspx?SIDRNAi目标序列的选取原则：

从转录本〔mRNA〕的AUG起始密码开头，查找“AA”二连序列，并登记其3”端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有争论结果显示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。

Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5”和3”端的非编码区〔untranslatedregions，UTRs)，缘由是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

将潜在的序列和相应的基因组数据库〔人，或者小鼠，大鼠等等〕进展比较，排解那些和其他编码序列

/EST同源的序列。

例如使用BLAST〔“:///BLAST/“/BLAST/〕

选出适宜的目标序列进展合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA

序列。

阴性比照

一个完整的siRNA试验应当有阴性比照，作为阴性比照的siRNA应当和选中的siRNA序列有一样的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。

目前已证明的siRNA可以在下面的网页找到：“://design.dharmacon/catalog/category.aspx?key=49“://design.dharmacon/catalog/categ