PCR技术的发展和应用-基础知识.docx

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其次十二章

聚合酶链反响〔PCR〕技术的进展和应用

第一节概述

聚合酶链反响或多聚酶链反响〔PolymeraseChainReaction,PCR〕，又称无细胞克隆技术(“freebacteria”cloningtechnique)，是一种对特定的DNA片段在体外进展快速扩增的方法。该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107～108倍，大大提高了DNA的得率。因此，现已广泛应用到分子生物学争论的各个领域。

PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传争论室KaryMullis及同事于1985年觉察并研制成功的；最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于β-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。随后使用了1976年Chien等分别的热稳定性TaqDNA聚合酶，使PCR操作大为简化，并使PCR自动化成为可能；1987年KaryMullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进展有用阶段。

国内复旦大学1988年起开头研制耐热性多聚酶，军事医学科学院马立人教授等在1989年研制成功了PCR自动装置，并且不断推陈出，最近研制的PTC-51A/B型DNA热循环仪体积小，造型美观，价格适宜，操作简洁，尤为适宜国内应用。

PCR制造不到10年，却已获得广泛应用。目前，每年都有上千篇文章发表。1991年，期刊“PCR方法与应用”〔PCrMethodsandApplication〕在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。PCR技术作为一种方法学革命，必将大大推动分子生物学各有关学科的争论，使其到达一个的高度。

1993年度诺贝尔化学将已于10月13日揭晓，KaryMullis因制造了“聚合酶链式反响”而获得此殊荣。现在世界各地都在使用PCR检测病人血液中的微量遗传物质，这一成就为准确诊断艾滋病及其它病症铺平了道路。瑞典皇家科学院说：“PCR方法已经广泛应用于生物医学中。该方法同DNA测序法结合起来很可能将成为争论动植物分类学的一种革工具。”一名加拿大籍英国科学家MichaelSmith因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法而与Mullis同享此荣。

其次节PCR技术的原理

PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由高温变性、低温退火和适温延长三个步骤反复的热循环构成：即在高温〔95℃〕下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温〔37～55℃〕状况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成局部双链；在Taq酶的最适温度〔72℃〕下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延长，合成DNA链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延长三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进展，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式快速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。

图22-1 PCR根本原理示意图

假设扩增效率为“X”，循环数为“n”，则二者与扩增倍数“y”的关系式可表示为：y=(1+X)n。扩增30个循环即n=30时，假设X=100%，则y=230=1073741824(109)；而假设X=80%时，则y=1.8306(107)。由此可见，其扩增的倍数是巨大的，将扩增产物进展电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灶照耀下〔254nm〕一般都可见到DNA的特异扩增区带。

第三节PCR操作范例及反响体系的组成

一、PCR操作范例

在一个典型的PCR反响体系中需参加：适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg2+和两个合成的DNA引物。模板DNa94℃变性1min，引物与模板40～60℃退火1min，72℃延长2min。在首次循环前模板预变性3～5min；在末次循环后，样品仍需连续延长3～

5min以上，确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反响中各成份的组成，参加量和反响条件，使人们以此为根底，对不同的争论对象逐项转变来找到最正确反响条件，特列举PerkinElmerCetus公司GeneAmpDNA试剂盒供给的典型反响条件供参考。

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成分参加体积〔μl〕最终