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分子生物学试验报告
试验名称:PCR反响及PCR产物的鉴定、回收与载体连接
班级:生工xx姓名:xxx学号:xxxx日期:xxx
引言
PCR反响及PCR产物的鉴定、回收与载体连接
聚合酶链式反响〔polymerasechainreaction,PCR〕是体外酶促合成特异DNA片断的一种技术。由于这种方法高效、敏感、特异性高[1],因而在分子生物学、基因工程争论以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和争论中得到广泛应用。通过本次试验来学习PCR反响的根本原理与试验技术,了解引物设计的一般要求,同时学习PCR产物的回收及其与载体连接的原理和方法。
材料和方法
试验原理
PCR反响的根本原理
聚合酶链式反响〔PCR〕是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火〔复性〕及适温延长等几步反响组成一个周期,循环进展,使目的DNA得以快速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点[2]。PCR进展的根本条件是:以DNA为模板〔在RT-PCR中模板是RNA〕;以寡聚核苷酸为引物;需要4种dNTP作为底物;有耐高温的TaqDNA聚合酶。PCR每一个循环由三个步骤组成:①变性:加热模板DNA,使其解离成单链;②退火:降低温度,使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板DNA所需扩增序列结合;③延长:在适宜温度下,DNA聚合酶利用dNTP使引物3’端向前延长,合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。
每一个循环产物可作为下一个循环的模板,因此通过35-45个循环后,目标片段的扩增可达106-107倍。
由于DNA的琼脂糖凝胶电泳已于试验一具体阐述与试验,此次不再赘述。
PCR产物的回收与载体连接原理
DNA片段回收方法:DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中通上肯定电压进展电泳,不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分别开。切下带有所需DNA片段的凝胶,用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。本试验承受胶回收法来回收PCR产物。
利用Taq酶能够在PCR产物的3”末端加上一个非模板依靠的A,而T载体是一种带有3”T突出端的载体,在连接酶作用下,可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点,可用于PCR产物的克隆和测序。
其中,pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物(TACloning)的专用载体。这种载体是由pUC18载体改建而成,在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点,用EcoRV进展酶切反响后,再在两侧的3”端添加“T”而成。因大局部耐热性DNA聚合酶进展PCR反响时都有在PCR产物的3”末端添加一个“A”的特性,所以使用这两种制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。该载体携带有抗氨苄青霉素基因,因而使承受了该质粒的受体菌具有
抗氨苄青霉素的特性,同时还能进展蓝白斑筛选[2。]图1为pMD18-TVector的克隆位点图。
试验材料
药品及试剂
所用药品及试剂有电泳液〔TAE缓冲液〕;模板;上下游引物;dNTP;buffer;
rTaq酶;0.9%琼脂糖;荧光染料;loadingbuffer;DNAMarker;酚氯仿异戊醇;
3mol/L的NaAc(PH5.2);无水乙醇;70%乙醇;TE溶液;T载体;ddH2O;SolutionI。
图1
图1pMD18-TVector的克隆位点图
试验仪器用具
用到的仪器及用具有台式型离心机、旋涡混合器、移液枪、锥形瓶、微波炉、琼脂糖凝胶电泳仪、PCR扩增仪、紫外线透射仪等。
试验方法
PCR反响:在PCR管中用移液枪分别参加0.5ul模板、0.3ul上下游引物、2uldNTP、2ulbuffer、14.65ulddH20、0.25ulrTaq酶,混匀,共计20ul。在PCR扩增仪上设置扩增程序:预变性条件为94℃下加热3min,变性条件为94℃下加热30s,退火条件为60℃下加热30s,延长条件为72℃下加热45s〔设置30个循环〕,末端延长条件为72℃下加热10min,于4℃下可永久保存。
PCR产物凝胶电泳:用胶带将制胶板两头封严,然后配0.9%琼脂糖凝胶30ml:称取0.27g琼脂糖参加1×TAE缓冲液30ml,用微波炉溶胶。冷却至不烫手加荧光染料2ul混匀,倒胶,马上插上梳子,冷却20min,轻轻拔出梳子,马上将凝胶板放入电泳槽,倒入1×TAE电泳缓冲液,使电泳液完全没过胶。将5ulPCR产物与1ulloadingbuffer混匀点入点样孔,最终点5ulDNAMarker。连接电泳槽,留意正负极,DNA从负极向正极跑
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