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构建基于CRISPRCas9技术敲除ALOX5的质粒汇报人：2024-01-24

CATALOGUE目录引言ALOX5基因概述CRISPR-Cas9敲除ALOX5质粒设计CRISPR-Cas9敲除ALOX5质粒制备CRISPR-Cas9敲除ALOX5质粒验证CRISPR-Cas9敲除ALOX5质粒应用前景

01引言

目的和背景ALOX5基因编码的酶参与花生四烯酸的代谢，与炎症、癌症等疾病密切相关。通过敲除ALOX5基因，可以研究其在疾病发生发展中的作用。研究ALOX5基因在疾病中的作用通过CRISPR-Cas9技术敲除ALOX5基因，有望为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。开发新的疾病治疗方法

CRISPR-Cas9是一种基于细菌免疫系统的基因编辑技术。它利用Cas9蛋白和向导RNA（gRNA）的复合物，在特定DNA序列上进行切割，从而实现基因敲除、插入或修复等操作。CRISPR-Cas9技术的原理CRISPR-Cas9技术已被广泛应用于基因功能研究、疾病模型构建、基因治疗等领域。它具有操作简便、效率高、特异性好等优点，为基因编辑领域带来了革命性的变革。CRISPR-Cas9技术的应用CRISPR-Cas9技术简介

02ALOX5基因概述

参与炎症反应白三烯类化合物在炎症反应中起重要作用，因此ALOX5基因的表达与炎症反应密切相关。调节细胞增殖和分化除了参与炎症反应外，ALOX5基因还参与调节细胞增殖和分化过程。编码花生四烯酸5-脂氧合酶ALOX5基因负责编码花生四烯酸5-脂氧合酶，该酶是合成白三烯类化合物（如LTB4）的关键酶。ALOX5基因功能

哮喘研究表明，ALOX5基因的多态性与哮喘的易感性有关，某些特定基因型可能增加哮喘的风险。动脉粥样硬化白三烯类化合物在动脉粥样硬化形成过程中起重要作用，因此ALOX5基因的表达可能与动脉粥样硬化的发生和发展有关。癌症一些研究表明，ALOX5基因在某些癌症中表达异常，可能与癌症的发生和发展有关。然而，具体的作用机制和影响因素仍需进一步研究。ALOX5与疾病关系

03CRISPR-Cas9敲除ALOX5质粒设计

设计策略及原理基于CRISPR-Cas9技术，通过设计特定的sgRNA引导Cas9蛋白对ALOX5基因进行定点切割，从而实现基因敲除。利用CRISPR-Cas9系统的特异性，确保只针对ALOX5基因进行编辑，避免脱靶效应。

sgRNA设计与合成针对ALOX5基因序列，选择特异性高的靶点，设计对应的sgRNA序列。利用在线设计工具或专业软件，对sgRNA序列进行评估和优化，确保其高效性和特异性。将设计好的sgRNA序列合成，并克隆到适当的表达载体中，以便在细胞中表达。

将合成好的sgRNA表达框克隆到质粒载体中，构建成完整的CRISPR-Cas9敲除质粒。对构建的质粒进行测序验证，确保其序列正确无误。选择适用于哺乳动物细胞的质粒载体，如pSpCas9(BB)-2A-Puro或lentiCRISPRv2等。质粒载体选择与构建

04CRISPR-Cas9敲除ALOX5质粒制备

感受态细胞制备及转化将构建好的CRISPR-Cas9敲除ALOX5质粒与感受态细胞混合，通过热激或电穿孔等方法将质粒导入细菌内。质粒转化通常使用大肠杆菌（E.coli）作为宿主菌，如DH5α或Stbl3等。选择合适的细菌种类通过化学方法（如CaCl2法）或物理方法（如电穿孔法）使细菌处于易于接受外源DNA的状态。制备感受态细胞

质粒扩增将转化后的细菌接种到含有适当抗生素的选择性培养基中，进行扩增培养。质粒提取使用碱裂解法或试剂盒法等方法从细菌中提取质粒。质粒纯化通过凝胶电泳等方法对提取的质粒进行纯化，去除杂质和降解的DNA。质粒扩增与提取030201

质粒浓度检测使用分光光度计或荧光定量仪等方法测定质粒的浓度。质粒纯度检测通过凝胶电泳观察质粒的条带是否单一、清晰，以及是否有RNA和蛋白质等杂质污染。质粒活性检测通过转化实验等方法检测质粒的活性，确保其具有正常的生物学功能。质粒浓度和纯度检测

05CRISPR-Cas9敲除ALOX5质粒验证

细胞复苏与传代从液氮罐中取出冻存的细胞，迅速放入37°C水浴中解冻，然后加入预热的完全培养基中，轻轻吹打混匀，放入培养箱中培养。待细胞密度达到80%-90%时，进行传代。细胞转染将构建好的CRISPR-Cas9敲除ALOX5质粒与转染试剂按照一定比例混合，室温静置20分钟后，加入到细胞培养基中，轻轻混匀，放入培养箱中继续培养。细胞培养及转染

123收集转染后的细胞，使用DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA。DNA提取设计特异性引物，以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到包含ALOX5基因片段的PCR产物。PCR扩增将PCR产物送测序公司进行测序，与野生型序列比对，