PCR技术(包含引物设计)知识.docx

PCR

技术(包含

计)

引物设

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聚合酶链式反响〔PCR〕

原理：

原理：

DNA的半保存复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，依据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在试验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化掌握DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，参加DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的自然复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引

物。

物。

PCR由变性-退火(复性〕-延长三个根本反响步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右肯定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作预备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延长：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反响原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条的与模板DNA链互补的半保存复制链，重复循环就可获得更多的“半

保存复制链”，而且这种链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4

分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR

PCR技术分类〔常用〕

反向PCR技术(InversePCR,IPCR)：反向PCR是克隆序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布状况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。

锚定PCR技术(AnchoredPCR,APCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段序列,然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进展

扩增,称为APCR。

不对称PCR技术(asymmetricPCR)：两种引物浓度比例相差较大的PCR

技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度,常用50～100÷1比

例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导的PCR反响就会产生大量单链DNA。

反转录PCR技术(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)：当扩增模板为RNA时,需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进展扩增。应用格外广泛,无论是分子生物学还是临床检验等都常常承受。

巢式PCR技术(NEST-PCR)：先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量,然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带,此为巢式PCR。假设用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为削减巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些,且用量较少,同时在第一次PCR时承受较高的退火温度而其次次承受较低的退火温度,这样在第一次PCR时,由于较高退火温度下内引物不能与模板结合,故只有外引物扩增产物,经过假设干次循环,待外引物根本消耗尽,无需取出第一次PCR产物,只需降低退火即可直接进展PCR扩增。这不仅削减操作步骤,同时也降低了穿插污染的时机。这种PCR称中途进退式PCR，主要用于极少量DNA模板的扩增。

多重PCR技术(multiplexPCR)：在同一反响中用多组引物同时扩增几种基因片段,假设基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消逝。主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。

重组PCR技术：重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中,两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR条件下发生聚合延长反响,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。

原位PCR技术：利用完整的细胞作为一个微小的反响体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片