PCR(聚合酶链式反应)技术与应用.docx

PCR〔聚合酶链式反响〕技术与应用

一．PCR技术的原理

聚合酶链式反响〔PCR〕是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，即通过试管中进展的DNA复制反响，是极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增上百万倍。其反响原理与细胞内DNA复制相像，但PCR反响体系要简洁得多，主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3’末端互补的合成引物、4种dNTP、耐热DNA聚合酶及适合的缓冲体系。

与细胞内的DNA复制相像，PCR也是一个重复地进展DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化形成的DNA链的过程，这些过程都是通过掌握反响体系的温度来实现的。PCR包括以下三步反响：

变性〔denaturation〕：将反响体系混合物加热到94℃维持较短时间〔大约

15~30s〕，是目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反响的模板。

m退火〔annealing〕：将反响体系冷却至特定温度〔引物的T值左右或以下〕，引物与DNA模板的互补区结合，形成模板-引物复合物。必需准确的计算退火的温度以保证引物只与相对应的序列结合。由于模板链分子较引物简单得多，加之引物量大大超过模板DNA的数量，因此，DNA模板单链之间互补结合的时机很少。

m

延长〔elongation〕：将反响体系的温度提高到72℃并维持一段时间，引物在耐

热DNA聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以四种单核苷酸〔dNTP〕作为底物，合成的DNA链。因此，在这一阶段的末期，两条单链模板DNA又形成的双链，且双链中的生DNA单链具有各种不同的延长长度。

以上三步作为一个循环重复进展，每一个循环的产物作为下一循环的模板。因此，在其次轮循环中进展变性、退火、延长这三步反响。如此循环20次，原始DNA将扩增约106倍，而循环30次后将达109倍。而全部上述过程将在1~2h内完成。经过扩增后的DNA产物为大多介于引物与原始DNA相结合的位点之间的片段，而在反响前几轮循环产生的超过引物结合位点的较长链的DNA的比例将随着循环不断地进展稀释至可以无视的程度。

二．PCR的反响体系

PCR的根本反响体系包括：需要扩增的模板(template)、一对寡核苷酸引物〔primers〕、维持pH的反响缓冲系统〔reactionbuffersystem〕、一价或二价阳离子〔monovalentordivalentcations〕、四种三磷酸脱氧核糖核酸〔dNTP〕、催化依靠模板的DNA合成的耐热DNA聚合酶及PCR促进剂等。

模板

模板可以是基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、扩增后的DNA、cDNA等，对RNA的扩增要首先反转录成cDNA后才能进展正常的PCR循环。含有靶序列的DNA可以单链或双链形式参加PCR混合液。通常小片段模板DNA的PCR效率要高于大分子

〔未消化的真核基因组〕DNA，因此PCR反响前用机械剪切或用切点罕见的限制酶〔Sac

I或NotI〕消化基因组DNA，以提高产量。

反响中PCR模板的用量依DNA的性质而定，用哺乳动物基因组DNA、酵母、细菌和质粒做模板时，每个反响的模板量分别为1μg、10ng、1ng和1pg。DNA样品要尽量纯洁，尤其不能有核酸酶及蛋白水解酶等有害于PCR反响的物质存在。

引物

PCR扩增产物的大小及扩增靶序列在基因组中的位置是由引物限定的。因此，引物的选择关系到PCR的特异性。

a)引物设计的原则

引物设计的根本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能的抑制非特异性扩增。引物设计的根本要求如下：

引物的长度至少为16bp,通常为18~30bp，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性〔efficiency〕，扩增出的产物种类会增多。

解链温度〔Tm值〕引物的Tm值是一个格外重要的参数，Tm值的凹凸打算退火的温度。两个引物之间的Tm值差异好在5℃之内，可以保证两个引物正确退火。Tm值的计算方法很多，一般推举承受专业的引物设计软件进展计算。

G+C含量G+C含量一般在40%~60%。四种碱基随机分布，避开碱基积存的现象。IV引物自身引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp的自身互补序列，否则引物会自身折叠，形成发夹形构造，影响引物与待增DNA中的靶序列杂交结合。

引物之间引物之间不应存在互补序列，尤其应避开3’端的互不重叠，以避开形成引物二聚体。

3’末端3’末端最好是G、C。避开使用A、T。也不应有3个连续G或C，否