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Pichia酵母表达系统使认真得
摘要:Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。
甲基酵母局部优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统,具有肯定的蛋白质翻译后加工,-+有利于真核蛋白的表达优点2.AOX强效启动子,外源基因产物表达量高,可以到达++++每升数克表达产物的水平3.酵母培育、转化、高密度发酵等操作接近原核生物,+++=远较真核系统简洁,格外适合大规模工业化生产。4.可以诱导表达,也可以分泌表达,便于产物纯化。=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物,局部甲醇酵母更可++++以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源,生产本钱低生物通编者按:甲醇酵母表达系统有不少优点,其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知,并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简洁表达量高,但是在实际操作中,并不是每个外源基因都能顺当得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题,生物通编者特地收集了局部用户在使用EasySelectPichiaExpressionSystem这个被誉为最简洁的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中
甲基酵母局部优点
与其他真核表达系统比较
与原核表达系统比较
1.属于真核表达系统,具有肯定的蛋白质翻译后加工,
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有利于真核蛋白的表达优点
2.AOX强效启动子,外源基因产物表达量高,可以到达
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每升数克表达产物的水平
3.酵母培育、转化、高密度发酵等操作接近原核生物,
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远较真核系统简洁,格外适合大规模工业化生产。
4.可以诱导表达,也可以分泌表达,便于产物纯化。=
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5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物,局部甲醇酵母更可
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以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源,生产本钱低
+表示优胜于;-表示不如;=表示差不多
EasySelectPichiaExpressionSystem
产品性能:
优点——使用简洁,表达量高,His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会消灭蛋白切割问题
全面产品报告及心得体会:
巴斯德毕赤酵母〔Pichiapastoris〕是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种,一方面由于其是属于真核生物,因此表达出来的蛋白可以进展糖基化修饰,另一方面毕赤酵母生长速度快,可以将表达的蛋白分泌到培育基中,便利蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点〔MCR〕3”端带有his-tag和c-mycepitopes,这些tag有利于常规检测和纯化,而且在MCR5”端引入了alphafactor〔α-factor〕用以增加表达,并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进展克隆的时候,假设你选择的是EcoRI,那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记,而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG廉价。
第一步构建载体
XiangYang:pPICZ系列有很多克隆位点可供选择,同时也有三种读码框以便不用的用户需要。
红叶山庄:有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列?pPIC9K属于穿梭质粒,也可以在原核表达,而pPICZ系列比较简洁操作,大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选〔PIC9K操作麻烦一点,大肠用amp抗性,而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆,在利用G418筛选多拷贝〕,而且对于大小适宜〔30—50KD〕的蛋白在产量上是pPIC9K无法比较的。
leslie:要做毕赤酵母表达试验,首先固然就要了解这个得意的酵母了〔椭圆形,肥嘟嘟的,格外得意,〕她和大肠杆菌长得有较大区分〔大肠杆菌是杆状的〕,因此在培育的过程中要区分这两种菌体,除了气味,浓度,颜色以外,也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应当都遇过这种状况吧,表达过程中染菌〔我们试验室曾经污染过各种颜色外形的细菌,那真是一段可怕的经受〕,假设在不知情的状况下连续做下去,那可以就是铺张大把的时间了。
根本生疏了毕赤酵母,了解了她生长的喜好〔多糖偏酸环境〕,生长的周期等等状况后,固然更多的精力还是应当花在表达的目的蛋白上,我的表达蛋白有些恐惧,有100KD,原来固然应当放在大肠杆菌中表达,但是为了分泌表达〔其实后来觉察大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错〕和糖基化修饰〔主要是这个方面,因
为我的蛋白是人源的,表达出来用于酵母双杂,因此需要有完备的糖基化修饰〕。这样我的DNA片段由于较长,所以在做克隆的时候也要格外留神,需要留意的是:
①酶切位点不能消灭在目的DNA片段中——假设片段长无法避开,可
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