H7亚型禽流感RT-PCR诊断方法的建立.doc

H7亚型禽流感RT-PCR诊断方法的建立

摘要：参照GenBank中已发表的H7亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因设计合成了一对预计扩增片段大小约为310bp的引物。利用这对引物，通过对RT-PCR反应体系和反应条件的优化，建立了针对H7亚型禽流感的RT-PCR检测方法。敏感性试验和特异性试验结果表明，该方法敏感性高，最低可检出100pg的AIV-H7的mRNA，且应用该引物对新城疫病毒（NDV）传染性支气管炎病毒（IBV）及其它亚型的流感病毒（H1H3H5H9）在相同反应条件下未扩增出任何片段具有较好的特异性。用所建立RT-PCR方法检测发病鸡组织病料及咽肛拭子，检测结果与鸡胚病毒分离结果相比阳性符合率高达906％。

关键词：H7亚型禽流感病毒；RT-PCR；检测

DevelopmentandoptimizationofaRT-PCRmethodfordetectingH7subtypeofavianinfluenzavirus

XuShan，ZhangTingting，ChenZidong,AoYanhua,QiuXiaoyan,RenTao,XinChaoan

(VeterinaryCollegeofSouthChinaAgriculturalUniversity,GuangZhou,510640)

Abstract:AspecificRT-PCRdetectionsystemwasdevelopedandoptimizedtodetecttheH7subtypeavianinfluenzavirus(AIV)ApairofspecificprimersweredesignedforH7subtypeAIV,whichwerepredictedtoamplifyaproductof310bpinlengthThesensitiveandthespecificassaysindicatedthataslittleas100pgofmRNAisolatedfromH7subtypeAIVwasdetected,andonlyH7subtypeAIVcouldbedetectdeThecoincidenceofpositiveratewasupto906%betweenthisRT-PCRassayandtheviralisolationofembryosfordetectingtissuesandswabsofnonimmunefowlThemethodprovidedarapid,simple,safe,sensitive,subtype-specificdignosisforH7subtypeofAIVinclinicalsamples

Keywords：H7subtypeofavianinfluenzavirus;RT-PCR;Detection

禽流感（AvianInfuenza,AI）是由正黏病毒科流感病毒属的A型流感病毒引起的禽类的一种从呼吸系统感染到严重的全身性败血症等多种症状的综合症。被国际兽疫局定为A类传染病，我国把高致病性禽流感列为一类传染病[1,2]。A型禽流感病毒基因组由8个基因片段PAPB1PB2NSNPMHANA组成，共编码10种蛋白。在病毒的表面结构蛋白中，HA的变异幅度最大，也是诱导体液免疫的最主要保护性抗原。根据血凝素HA和神经氨酸酶NA不同的抗原性，目前已发现AIV有15种特异的HA和9种特异的NA。迄今为止，造成AI大爆发的AIV均为H5和H7亚型[3,4,5]。从1959年开始，H7亚型的禽流感相继在欧洲和大洋洲爆发。进入本世纪，H7亚型AIV疫情也不断有报道。虽然我国暂无H7亚型AIV的爆发，但台湾韩国等周边地区及国家已有发生，所以建立一套敏感特异快速的H7亚型AIV监测预防措施是非常必要的。鉴于目前检测AIV常用的鸡胚病毒分离法耗费的时间长，且存在散毒的危险，本文利用聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）的敏感特异快速的优点[6]，针对H7亚型AIV的HA基因设计并合成特异性高的引物建立了H7亚型AIV的RT-PCR检测方法，并通过条件优化，提高诊断的敏感性和特异性，为H7亚型禽流感RT-PCR快速诊断试剂盒的研制打下坚实基础，对我国H7亚型禽流感的诊断和预防控制具有十分重要的意义。

1材料和方法

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