β－内酰胺类抗生素簇特异性抗体制备研究.doc

β－内酰胺类抗生素簇特异性抗体制备研究

1材料与方法

11主要材料

111试剂

注射用氨苄西林钠（购于华农大校医院）

动物用青霉素

牛血清白蛋白（BSA）

卵血清蛋白（OVA）

弗氏完全佐剂（FCA）

弗氏不完全佐剂（FIA）

酶标羊抗小鼠

N′N－二甲基甲酰胺（DMF）

25%戊二醇

30％双氧水(H2O2)

马血清

112主要仪器

各种规格移液枪

恒温磁力搅拌器

4℃和－20℃冰箱

酶标仪

紫外分光光度计

电子天平

恒温水浴箱

冷冻离心机

113其它材料

透析袋（新透析袋的处理：用蒸馏水煮沸10min，冷却至室温即可使用）

96孔酶标板

一次性注射器（1ml）

离心管

剪刀镊子

114ELISA各种试剂的配制

（1）包被液（01MPH96碳酸盐缓冲溶液）：将0636gNa2CO3和1172gNa2HCO3加到200ml蒸馏水中，装入试剂瓶中4℃保存备用。

（2）PBS贮存液（PH74，20倍）：4gKH2PO4,58gNa2HPO4?12H2O,4gKCl,定容到1000ml，室温贮存。

（3）PBST洗涤液（001MPH74）：取上述配备的PBS贮存液100ml，加入17gNaCl，再加入1900ml蒸馏水，加入1mlTween－20，混匀，室温贮存，长期贮存期间出现浑浊，不能用，另配。

（4）稀释液：取100mlPBST洗涤液，加入01g明胶溶解，明胶比较难溶解，37℃水裕放置1小时，过滤即可，4℃下保存（一个星期内有效）。

（5）底物缓冲液（PH50）：0933g柠檬酸，3689gNa2HPO4?12H2O，定容到200ml，4℃贮存（1个月内有效）。

（6）底物贮存液（发黄不可用）：80mg邻笨二胺溶于10ml底物缓冲液中，分装贮存（05ml/支），怕光，操作快速，-20℃贮存。

（7）显色液：临用前现配，取05ml底物贮存液避光快速解冻，加入95ml底物缓冲液，再加入16μl30％过氧化氢（H2O2），立即用，用后剩余的丢弃。

（8）终止液（10％硫酸）：取10ml浓硫酸，加入到90ml蒸馏水中，室温贮存。

（9）封闭液：2％的马血清。

12实验内容

121抗原的合成

（1）青霉素－戊二醛－载体蛋白复合物的制备：00145g氨苄青霉素溶解于1ml二甲基甲酰胺中，然后加到2ml溶有00248g载体蛋白的PH值为74浓度为015M的PBS溶液中。接着，在上述混合液中逐滴加入1875μl25％的戊二醛。在室温下用磁力搅拌机轻柔搅拌3h后，将反应物取出，在透析袋中用09％的生理盐水透析3天，每天换透析液3次。透析好的反应物分装后，保存于-20℃冰箱中。

（2）青霉素－载体蛋白复合物的制备：将50mg青霉素溶于2ml碳酸钠－碳酸氢钠缓冲溶液中，加入30ml载体蛋白，在37℃下恒温18h，取出反应物用09％的生理盐水透析3天，每24h换生理盐水3次。透析好的反应物分装后，保存于-20℃冰箱中。

122免疫抗原和合成抗原的合成

按照上述两种方法，分别用BSA（牛血清白蛋白）和OVA（卵血清蛋白）作为载体蛋白，合成完全抗原。其免疫抗原分别为氨苄青霉素－BSA和青霉素－BSA，其包被抗原分别为氨苄青霉素－OVA和氨苄青霉素－OVA。

123完全抗原的鉴定

将合成的完全抗原载体蛋白和原药按照合成的比例分别稀释到合适的浓度，然后分别对其进行紫外分光扫描，比较其图谱，分析其连接效果。

124考马斯亮蓝法测定合成抗原蛋白质的浓度

取6支试管，按下表数据配制0～1000μl/mL牛血清白蛋白溶液各1mL

管号

试剂

1

2

3

4

5

6

1000μl/mL牛血清白蛋白溶液（mL）

0

02

04

06

08

10

蒸馏水（mL）

10

08

06

04

02

0

蛋白质浓度（μl/mL）

0

200

400

600

800

1000

准确吸取所配各管溶液01mL，分别放入10mL具塞试管中，再加入5mL考马斯亮蓝G250蛋白试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用10mm光径的比色杯在595nm下比色，作出标准曲线。

将合成的抗原稀释到一定浓度后按上法与考马斯亮蓝溶液反应，测定其OD值，并将测定的OD值代入标准曲线中以求出合成抗原中蛋白质的浓度。

125抗体的制备

1251佐剂和免疫抗原的混合

将人工抗原慢慢解冻，根据完全抗原的实际浓度取出一定量，使其溶液中至少含有蛋白质100μg，然后加入等量的弗氏佐剂（第1次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂），混合物在旋涡混合器上充分振荡混合至W/O状态。

1252动物实验

选择两只健康的Balb/c小