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EBER原位杂交过程
所有的孵育步骤均应在密闭的湿盒中进行,避免试剂蒸发。一旦杂交程序开始,玻片不能干燥。
样品的收集和预处理
石蜡切片:
常规福尔马林缓冲液固定,时间不宜超过12小时。石蜡包埋的温度不宜超过65℃。4-6微米的石蜡切片,56-60℃烤片2-16小时。处理好的切片可以立即使用,也可放置于室温条件下保存(至少可保存3个月以上)。在做原位杂交之前,切片需经新鲜二甲苯脱蜡(10分钟×2)。脱蜡后的切片在新鲜100%乙醇中放置5分钟后,经空气干燥5-10分钟即可进行酶处理。
酶处理(避免RNA酶污染,带手套操作)
将切片放置于37℃中,每张切片加入300-400微升新鲜配制的胃酶工作液孵育。石蜡切片孵育30分钟。弃去胃酶工作液后,逐级酒精脱水(70%、95%和100%),每个梯度放置1分钟。空气干燥后杂交。
杂交程序(避免RNA酶污染,带手套操作)
杂交:
混匀探针溶液,在每张切片上加10-20微升适量的探针(试剂3),加盖盖玻片(注意防止气泡!)。湿盒中37℃孵育2小时,杂交过夜效果更好。
冲洗:
将切片浸入PBS缓冲液中10分钟,直到盖玻片自然脱落,用PBS缓冲液冲洗切片2分钟×3次,取出切片,擦干多余的缓冲液。
检测和显色程序
切片上加入适量辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(试剂4),37℃孵育30分钟,PBS冲洗1分钟×3次(期间可摇动容器数次),用蒸馏水或去离子水冲洗切片1分钟×1次。
擦净切片边缘的水分,加入适量配制好的DAB工作液。显色5-15分钟,注意光镜下观察显色情况。用蒸馏水或去离子水冲洗切片1分钟×3次后,即可进行封片或复染。
复染程序
可苏木素复染,染色约5-10秒。用蒸馏水或去离子水短时间冲洗,常规脱水、透明,封片。
无阳性表达可能原因:
1.塑料制品:尽可能使用无菌、一次性塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品,如没有开封使用过,通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,有些厂家提供的产品已达到RNase-free,可以直接使用,再次处理容易造成二次污染,得不偿失。但原则上国产塑料制品处理后方可使用。处理方法如下:
(1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入焦碳酸二乙酯(DEPC)使DEPC的终浓度为0.1%。注意:DEPC有致癌之嫌,须在通风柜中小心操作。
(2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
(3)在通风柜中37℃或室温下处理过夜。
(4)将EDPC水溶液小心倒入废液瓶中,用铝箔封住含DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
(5)用合适的温度(80-90℃)烘烤至干燥,置于干净处备用。
2.玻璃和金属制品:实验室用的普通玻璃和金属器皿经常有RNA酶污染,使用前必须于180℃干烤8小时或250℃烘烤3小时以上。另一种方法是用0.1%的DEPC水溶液浸泡。
3.电泳槽:用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净,再用水冲洗,用乙醇干燥,然后灌满3%的H2O2溶液,于室温放置10分钟,然后用0.1轕C处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿,塑料制品和电泳槽作上特殊标记,存放在指定地点,为RNA实验专用。
4.移液器:RNase的又一污染源是移液器。根据移液器制造商的要求对移液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗移液器的内部和外部,基本达到要求。移液器金属退头器是RNA酶的一个重要来源,实验前最好取下它。
5.溶液:用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液应用0.1轕C水于37℃至少处理12小时,然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034×105Pa)的高压下蒸气灭菌30分钟。注:DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液,可存几瓶新的,未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。
6.研究人员:RNA酶广泛存在于人的皮肤上,最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此,在准备分离和分析RNA的材料和溶液时,以及在涉及RNA的一切操作过程中,都应戴一次性手套,接触“脏的”玻璃器皿和其他物品以后,手套就可能沾染上RNA酶,因此进行RNA实验时应勤换手套。
一、?防止RNA酶污染的措施??
1.?所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。??
2.?塑料器皿可用0.1%?DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能
使用)。??
3.?有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3%?H2O
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