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WesternBlot 试验报

告

正式试验

客户姓名：报告日期：

一、客户样品及抗体登记

?样品种属来源：

.样品标记：

样品名称备注

样品名称

备注

.抗体名称：抗体来源：

抗体Cat.及lot号：

二、材料和方法

1.试剂及耗材

蛋白抽提试剂〔改进型RIPA配方〕BCA蛋白定量试剂盒

2mg/mlBSA标准品

5X复原样品缓冲液

10XTris-Glycine-SDS电泳缓冲液考马斯亮蓝染色液

10XTBSTpH8.0

中分子量蛋白marker〔7条带〕

中分子量预染蛋白marker〔7条带〕湿转缓冲液

NC膜，0.45um孔径 Millipore

丽春红染色液

BSAPMSF

蛋白酶抑制剂

磷酸酶抑制剂脱脂奶粉

ECL

Strippingbuffer〔抗体洗脱液〕

〔抗体需要选择，选择后把多余的删除〕

AmrescoAmrescoRocheRoche伊利

Millipore

山羊抗兔IgG〔H+L〕，HRP

山羊抗小鼠IgG〔H+L〕，HRP

兔抗山羊IgG〔H+L〕，HRPBeta-actin兔多抗

Beta-actin鼠单抗Beta-tubulin兔多抗Beta-tubulin鼠单抗

GAPDH兔多抗GAPDH鼠单抗2．试验仪器

Fresco低温冷冻离心机

MultiSkan3酶标仪MiniP-4电泳槽湿转电泳槽

电泳仪半干槽

水平脱色摇床

酸度计pH211

电动组织匀浆器

三、试验方法及结果

蛋白抽提

组织蛋白抽提

JacksonJacksonJackson

ThermoThermo

CavoyCavoyBio-RadBio-Rad

其林贝尔

HannaFluka

预冷RIPA蛋白抽提试剂，参加蛋白酶抑制剂〔磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂〕。在蛋白抽提开头前参加0.1MPMSF母液，PMSF终浓度1mM。称取组织重量以重量：裂解液体积=1:9比例参加裂解液，用眼科剪剪碎组织块，Fluka电动组织匀浆器15000rpm转速进展匀浆，每次10s，间隔10s，进展三次匀浆。匀浆时EP管需要浸入冰水混合物中进展降温。匀浆完成后在冰上孵育20min，4度离心，13000rpm，20min。离心完成后取上清，分装保存，待测。

细胞蛋白抽提

预冷RIPA蛋白抽提试剂，参加蛋白酶抑制剂〔磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂〕。在蛋白抽提开头前参加0.1MPMSF母液，PMSF终浓度1mM。细胞计数，以细胞数量1x107参加1ml裂解液，用枪头吹打充分悬起细胞，完成后在冰上孵育20min，4度离心，13000rpm，20min。离心完成后取上清，分装保

存，待测。

BCA法蛋白定量

预备BCA工作液A液：B液=50:1，稀释好各个提取BSA标准品。样品用PBS

进展稀释。

样品：BCA工作液=1:8，混匀后37度孵育30min或者室温孵育60min，酶标仪570nm波长滤光片读取OD值。

蛋白浓度计算见下表：

蛋白浓度调整

以RIPA调整蛋白浓度，参加 5X复原样品缓冲液后样品终浓度为

2-4mg/ml〔不同样品具体确定〕。煮沸变性5min。样品蛋白浓度调整见下表：

SDS-

依据目的蛋白的分子量，配制12%分别胶，浓缩胶浓度为5%。

待检测蛋白样品上样量：上样20ug

电泳条件：浓缩胶恒压90V,约20min，溴酚蓝进展分别胶界面；分别胶恒压

160V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。

用考马斯亮蓝染色液进展染色。染色结果见以下图：

目的蛋白WB正式试验

依据目的蛋白的分子量，配制%分别胶，浓缩胶浓度为5%。

待检测蛋白样品上样量：

电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min;分别胶恒压160V，通过预染蛋白

marker来确定电泳停顿时间。

湿转法，转膜条件：300mA恒流；0.45um孔径NC膜，转膜时间h。转

膜完成后丽春红染色试剂对膜进展染色，观看转膜效果。同时做好泳道标记，预备预试验时进展依据纵向泳道剪膜。

封闭：将膜完全浸没5%脱脂奶粉-TBST中室温轻摇60min。

一抗孵育：用5%脱脂奶粉-TBST稀释稀释一抗，室温孵育10min，放4C

膜编号一抗名称

膜编号

一抗名称

稀释比例

稀释后体积

备注：依据预试验中确定的稀释度进展正式试验选择一种内参进展同步预试验。

其次天从4度拿出膜，在室温孵育30min。洗膜：TBST洗膜5次，每次

3min。

二抗孵育：用5