WB实验的基本原理及操作流程.docx

WB试验的根本原理及操作流程

【试验原理】

一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延长称为Western(西)印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳区分出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶上区分出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。第一抗体专一地与待分别蛋自质的抗原决定簇结合，然后用另一种蛋自质，如135I-蛋白A或辣根过氧化物酶连接的山羊抗IgG检测已结合上去的抗体。本法所需时间6小时或过夜。

蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳

几乎全部蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进展，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能削减其相互间的聚拢。最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一复原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在到达饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进展，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动参加凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推动。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分别胶外表聚拢成一条很薄的区带(或称积层)。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于微小体积的力量，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的区分率。

最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)设计的，样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分别胶中含

Tris-Cl(pH8.8)的。系统中全部组分都含有0.1％的SDS(Laemmli,1970)，样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成跟随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分别胶前沿积聚，此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分别胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分别胶，并被筛分而依各自的大小得到分别。

【常用试剂】

30%丙烯酰胺/0.8%N,N’-亚甲丙烯酰胺

将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。

留神：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸取，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应慎重操作，由于它还可能含有少量未聚合材料。

4×Tris?Cl/SDS,pH8.8,

在300mlH2O中溶解91gTris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调整pH至8.8,补加H2O至体积500ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再参加2gSDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

4×Tris?Cl/SDS,pH6.8,

在40mlH2O中溶解6.05gTris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调整pH至6.8,补加H2O至体积100ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再参加0.4gSDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

4×SDS电泳缓冲液Trisbase24.2gGlycerin115.3g

20%SDS20ml

加水至总体积1000ml。

应用时稀释4倍即为1×SDS电泳缓冲液(Tris0.05M,Glycerin0.38M,SDS0.1%)。5)TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)

TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺的聚合。6)10%过硫酸铵

过硫酸铵供给驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%(w/v)的贮存液并保存于4℃。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周颖配制。

【操作步骤】

按厂商的使用指南用两块干净的玻璃，平板和0.75mm垫片组装电泳