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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(10)申请公布号CN102550864A
(43)申请公布日2012.07.11
(21)申请号CN201210000741.0
(22)申请日2012.01.04
(71)申请人河南科技大学
地址471000河南省洛阳市涧西区西苑路48号
(72)发明人冯书营王臣赵战勤李爱芳张小娟薛乐勋
(74)专利代理机构洛阳公信知识产权事务所(普通合伙)
代理人苗强
(51)Int.CI
权利要求说明书说明书幅图
(54)发明名称
一种抗禽流感的功能性饲料添加剂
的制备方法
(57)摘要
一种抗禽流感的功能性饲料添加剂
的制备方法,将人工合成H5N1亚型禽流
感病毒血凝素基因的部分片段和真核表达
载体pBI-221连接获得重组质粒,通过基
因枪、电转化等转化方法将获得的重组质
粒转化入杜氏藻细胞,使血凝素在杜氏藻
细胞中表达,制备得到表达病毒蛋白亚单
位的工程藻;将制备的工程藻细胞进行开
放式扩大培养后,收集藻体,然后经低温
干燥、制粒等加工工艺过程,得到一种抗
禽流感的功能性饲料添加剂。本发明所制
备的饲料添加剂应用于禽类养殖业具有抗
禽流感的免疫保护作用,能够提高禽类机
体的免疫力和生长速度,并且无任何毒副
作用,生物安全性好。
法律状态
法律状态公告日法律状态信息法律状态
权利要求说明书
1.一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备方法,其特征在于:其具体步骤为:
步骤一、工程藻的制备
(1)H5N1禽流感血凝素基因的制备:根据GenBank中登录的H5N1亚型禽流感
病毒的血凝素基因序列,人工合成血凝素基因的部分片段,其基因序列如序列表序
列1,然后采用PCR的方法对该基因片段进行扩增;PCR的上游引物为p1:
5’uTCTAGA/uATGCGCAGCATGTCCATACCATA3’,下游引物为p2:
5’uGAGCTC/uAATGTGGATTCTTTGTCTGC3’,下划线所指为上下游引物
分别引入的iXba/i?和iSac/i?酶切位点;
(2)真核表达载体的pBI-HA构建:将鉴定正确的血凝素基因片段进行
iXba/i?和iSac/i?双酶切,然后采用胶回收试剂盒回收血凝素基因片段片
段;将真核载体pBI-221进行iXba/i?和iSac/i?双酶切,同样进行胶回收
载体片段;然后通过T4连接酶连接血凝素基因片段和真核表达载体pBI-221,将
连接体系转化入大肠杆菌感受态,挑选阳性菌落培养后进行质粒的提取,采用
iXba/i?和iSac/i?进行双酶切鉴定血凝素基因片段是否成功构建入真核表
达载体中,得到正确的pBI-HA重组质粒,备用;
(3)利用电转化法将重组质粒转化杜氏藻细胞:将鉴定正确的重组质粒通过基因
枪、电转化等转化方法将重组质粒转化入杜氏藻细胞;通过对转基因细胞的筛选,
结合分子生物方法的鉴定,得到表达禽流感病毒亚蛋白单位的工程藻细胞;
步骤二、工程藻的扩大培养
将步骤一制备的表达禽流感病毒亚蛋白单位的工程藻细胞接种到15L玻璃瓶中进
行扩大培养,当细胞生长至对数生长期时,按1%的接种量接种于天然海水的藻类
养殖场,进行规模化的生产培养,培养约10-14天,细胞的浓度增加为
10sup6/sup个/ml;
步骤三、工程藻的收集和加工处理
当工程藻细胞生长至10sup6/sup个/ml时,对藻类细胞进行收集;可以采用静
止沉降或离心沉降法,批量的收集藻体;收集后的藻体经过低温干燥、制粒或与其
它营养成分混合加工后,得到一种抗禽流感的功能性饲料添加剂。
说明书
p技术领域
本发明涉及饲料添加剂领域,具体地说是一种具有抗禽流感病毒感染的禽用功能性
饲料添加剂
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