WB实验步骤总结.docx

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蛋白提取〔全部操作在冰上进展〕

裂解

配裂解液：PMSF=100：1，〔裂解液和PMSF在-20℃保存，提前一天4℃解冻〕取2ml裂解液，加20μlPMSF混匀

称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，参加600μl上述1中液体〔参加液体与组织比例为20：1〕，冰上静置10min

匀浆

先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，〔同时进展几组匀浆时，组间也要润洗钢头〕在匀浆机〔在生化室〕上每次匀浆10s，两次〔间隔5s〕，冰上静置30min

离心〔在根底4楼416室〕

自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管〔①，②两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置〕

将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min

用移液枪将上层清液取出放入①②号管中

变性〔上样缓冲液：样品=4：1〕将样品转移至2~3个0.5mlAP管中加上样缓冲液，100℃变性10min仪器屏幕：

S5

S5

00：10

S5

100．0

00：10

温度〔℃〕

时间〔时：分钟〕

保存

变性完毕后，翻开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用

WB试验步骤

清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

配制分别胶

预备：1ml枪〔蓝色枪头〕，200μl枪〔黄色枪头〕10μl〔白色枪头〕

10%分别胶的配置：〔用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板〕

5.91ml

5.91ml

超纯水

4.95ml

丙烯酰胺〔30%〕避光保存极易失效

3.75ml

Ph8.8Tris?HCL

150μl

10%SDS

150μl

AP〔催化剂促凝作用〕

9μl

TEMED

混合摇匀〔用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡〕

灌胶

沿玻璃板右上角缓慢匀速参加分别胶〔用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡〕保持液面平稳上升至上方绿色线为止

水封

马上用1ml超纯水进展水封〔利用重力把胶压平〕，如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min

5. 浓缩胶的配制〔5%〕

4.13ml

超纯水

1ml

750μl

丙烯酰胺〔30%〕避光保存极易失效

Ph6.8Tris?HCL

60μl

10%SDS

60μl

AP〔催化剂促凝作用〕

6μl

TEMED

搅拌混匀马上灌胶至溢出，插入梳子〔10孔或15孔〕凝胶30min或20min

电泳〔电泳液最多使用两次〕

安装电泳装置

低板对内，上方夹住，往两板中参加电泳液至黑线并观看是否漏液，缓慢拔掉梳子〔留意两手平衡拔出防止拔歪〕

点样〔不易时间过长，防止样品条带集中〕

Mark

Mark

4μl

〔Proternladder〕推举9μ，实际4μ已经足

够

样品

8μl

7-10μl均可内参挑齐即可

组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪

连接电泳仪

电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，翻开开关恒压电泳先调电压至70mV，跑约20min。〔Mark跑开，分出彩带即可〕

再调电压至120mV，跑约60min。〔不能跑过下面的玻璃板〕

注：Mark的条带从红色条带往下依次为：70→55→40→35→20，待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸泡

转膜〔转移液可用3-4次〕

剪四层滤纸〔大小与膜相，近可大不行小〕浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶全都大小〔胶始终保持潮湿〕

剪PVDF膜〔用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF膜〕，然后用甲醇活化10s以上

“夹三明治”再大塑料盆中参加少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、两层滤纸→胶→膜→两层滤纸〔胶的大分子量条带在上方，即在右上方〕

安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。参加转膜液至满〔否则仪器无法启动〕

翻开开关，调整电流至100mA，转膜2h〔恒流〕盆中加满冰转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色

封闭

小烧杯中混匀参加皿中配制5%脱脂奶粉：2.5g脱脂奶粉50mlTBST

小烧杯中混匀参加皿中

将膜取出放入上述参加了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min〔转移液回收其余清理掉，转移液可以重复利用2次〕

一抗

2l〔Psmad2l〕免抗1:10005μl：5ml58〔分子量〕2l〔Psmad2l〕免抗1:50010μl：5ml58

2l〔Psmad2l〕免抗

1:1000

5μl：5ml

58〔分子量〕

2l〔Psmad2l〕免抗

1:50