trizol法组织DNARNA及蛋白提取方法.docx

TRIzol法同时提取RNA、DNA、蛋白质

TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分别RNA。TRIzol试剂有多组分分别作用，与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分别一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在参加氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

RNA的提取

预备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS〔溶液均需用DEPC处理过的水配制〕。

操作步骤：

匀浆处理：

组织将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织参加1mlTRIzol，用匀浆仪进展匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

单层培育细胞直接在培育板中参加TRIzol裂解细胞，每10cm2面积〔即3.5cm直径的培育板〕加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应依据培育板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量缺乏可能导致提取的RNA有DNA污染。

细胞悬液离心收集细胞，每5～10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞参加1mlTRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

将匀浆样品在室温〔15～30℃〕放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分别。

每使用1mlTRIzol参加0.2ml氯仿，猛烈振荡15秒，室温放置3分钟。(我们是5分钟)

2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色〔我们见到的是红色〕有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

把水相转移到管中，如要分别DNA和蛋白质可保存有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol参加0.5ml异丙醇〔参加移出液相等体积〕，室温放置10分钟。

2～8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底消灭胶状沉淀。移去上清。

用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1mlTRIzol至少加1ml75℅乙醇。2～8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。

室温放置枯燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5～10分钟即可.不要真空离心枯燥，过于干

燥会导致RNA的溶解性大大降低。参加25～200μl无RNase的水或0.5℅SDS，用枪头吸打几次，55～60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反响，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

预防RNase污染留意事项：

常常更换手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。

使用灭过菌的RNA专用塑料制品避开穿插污染。

RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后连续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。

配制溶液应使用无RNase的水〔将水参加处理过不含RNase的玻璃瓶中，参加DEPC至终浓度0.01℅v/v，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需留神操作〕。

留意事项：

1.从少量样品〔1～10mg组织或102～104细胞〕中提取RNA时可参加少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5～10μgRNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反响。2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75%酒精中2～8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30～60分钟。预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：

肝和脾6～10μg，肾3～4μg，骨骼肌和脑组织1～1.5μg，胎盘1～4μg，上皮细胞8～15μg，成纤维细胞5～7μg。

常见问题分析：

得率低：

A.样品裂解或匀浆处理不彻底。B.RNA沉淀未完全溶解。A260/A2801.65：

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