第三章-细胞生物学研究方法.ppt

第三章细胞生物学研究方法;细胞形态结构的观察方法;一、光学显微镜技术（lightmicroscopy);普通复式光学显微镜技术;;;;;光镜样本制作

;?相差显微镜（phase-contrastmicroscope）

将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞

?微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）

偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成

明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究

活细胞中较大的细胞器图

?录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）

计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活

细胞中的颗粒及细胞器的运动

;;12;AcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.

a)underbright-field;

b)phase-contrast;

c)DIC;14;荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）;荧光显微镜及其照片;激光共焦扫描显微镜技术

（LaserScanningConfocalMicroscopy）;激光共聚焦扫描显微镜;;荧光共振能量转移（FRET）技术;FRET

原理图;与融合蛋白表达检测FRET;荧光漂白恢复技术;;二、电子显微镜技术;电镜种类;电镜与光镜的比较;电镜与光镜光路图比较;电子显微镜的基本构造;JEM-1011透射电子显微镜;主要电镜制样技术;超薄切片技术;Examplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.

Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).;?冰冻蚀刻技术（Freezeetching）

冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。

?电镜三维重构技术

电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。

电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）

——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。;冰冻蚀刻技术;电镜三维重构技术;扫描电镜

（scanningelectronmicroscope，SEM）;JEOL扫描电子显微镜;三、扫描遂道显微镜;?装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。

?特点：

（1）可???晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。（侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）；

（2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息；

（3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量；

（4）可连续成像，进行动态观察。

?用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。;41;第二节细胞组分的分析方法;一、离心分离技术;高速、超速和梯度密度离心分离各种细胞器、生物大分子及其复合物;?差速离心（Differencialcentrifugation）：

在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。

?密度梯度离心：

用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。

用于精细组分或生物大分子的分离。;差速离心;;二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法

;;;;三、特异蛋白抗原的定位与定性;免疫荧光技术;;免疫电镜技术;四、细胞内特异核酸的定位与定性;;五、放射自显影技术

（radioautography；autoradiography)）;放射性自显影技术;六．定量细胞化学分析技术;61;;;细胞培养、细胞工程与显微操作技术;一、细胞的培养;Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养;;二、细胞工程;;;图2-18