T载体的克隆_原创精品文档.pdf

实验原理

重组质粒的构建

T质粒载体

重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中，

将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接

酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶

还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或

增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分

为3步：首先，T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物

再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸

二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。

很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个

突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的

T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的

催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合

是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限

度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

感受态制备原理

细菌在0°CCaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的

感受态。

β-半乳糖甘酶显色反应选择法

LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳

糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，

呈蓝色。

一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半

乳糖核苷酶N端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克

隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的表达。另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C

端部分序列（β肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码

的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿

主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽

段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互补，形成完整

的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。

而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ基因不能表达，

从而不能合成β—半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过α互补合成β—

半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物X-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。

实验过程

一目的基因片段与载体连接

器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面离心管架，台式

离心机，干式恒温气浴。

试剂

T载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液，无菌ddWater

操作步骤

PCR产物与T载体直接连接：

（1）事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14~16°C。

（2）取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：（需要调整）

4ul目的基因

1ulT载体

0.5ulT4DNA连接酶（TAKARA,350U/ul）

1ul连接酶缓冲液10xbuffer

3.5ulddWater

总量10ul体系

（3）