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生化实验报告

实验一过氧化物酶同工酶的分离提取

一、实验目的

1、初步掌握蛋白质分离纯化的一般步骤，熟悉

离心的使用及蛋白质提取中的注意事项。

2、了解过氧化物酶的作用。

二、原理：

过氧化物酶是植物提内普遍存在、活性较高

的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的

氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，

它的活性不断发生变化，因此测定这种酶的活

性，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

本实验以苜蓿种子为材料，低速离心去除细

胞碎片，上清用丙酮或硫酸铵沉淀得过氧化物酶

同工酶粗品。

三、实验材料、器材及试剂：

（一）材料：苜蓿种子

（二）器材：研钵、超声波粉碎仪、高速冷冻

离心机酸度计

（三）实验试剂：

1．丙酮

2．提取缓冲液PBS。

四、实验步骤

1．精确称取4g左右植物样品（若是苜蓿种

子，提前用水溶胀好，）加15ml提取缓冲液匀浆；

[先将种子称好研碎，再逐渐加入提取缓冲液，

匀浆用去10ml，最后洗涤用5ml]

2．13000g离心10min；

3．取清液（量体积），沉淀弃去（清液少许

低温保存测定酶活和含量样1）；

2

3

蛋白质浓度范围内（1～1000μg），蛋白质

与色素结合后在595nm吸光值的大小与蛋白质

的浓度呈正比，故可用于蛋白质的定量测定。

考马斯亮蓝G-250与蛋白质的结合十分迅

速，2min左右即可达到平衡，其结合物在室温

下1小时内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，

干扰物较少，是一种比较好的定量方法。其缺点

是在蛋白质浓度太高时线形偏低，且不同来源蛋

白质与色素的结合状况有一定差别。

三、实验材料、试剂和仪器设备

（一）材料

苜蓿种子

（二）仪器设备

722分光光度计烧杯量筒移液管具

塞刻度试管

（三）试剂

1．标准牛血清白蛋白溶液（100μg/ml）。

2．考马斯亮蓝G-250：

四、实验步骤

（一）标准曲线的绘制

取6支具塞刻度试管，按下表依次加入标准

蛋白，向各管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5ml，

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摇匀，放置5min左右，用1cm的比色皿在595nm

处测定吸光值，以蛋白的μg作纵坐标，吸光值

为横坐标绘制标准曲线。

表绘制标

准曲线各试剂加入量

管号123456

标准蛋白质（ml）00.10.20.30.40.5

蒸馏水（ml）1.00.90.80.70.60.5

换算出的每管的

标准蛋白质(μg)01020304050

（不用加）

(二)样品的测定

取7支具塞刻度试管，空白1支，其它6支

分别加入实验一的3、5、6步骤中的样品(每一

样品2个平行样)0.1ml,各加用蒸馏水0.9ml，向

各管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5ml，充分摇

匀，放置2min左右，用1cm的比色皿在