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栏目化药药物评价化药质量控制

标题抗生素微生物检定法简介及在药品申报中应关注的一些问题

作者张敏蒋煜

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审评三部张敏蒋煜

摘要：本文结合中国药典要求，初步探讨了抗生素微生物检定法在抗生素含量测定

中的应用、不同的测定方法及其特点，测定过程中的注意事项等内容。旨在提请申请

人注意在对该部分进行研究时，一方面需要根据不同目的选择合适的检测方法，另一

方面需要注意影响各方法测定结果的因素，重视方法学验证。

关键词：抗生素微生物检定法，方法验证。

一、概述

抗生素微生物检定法是利用抗生素在低微浓度下选择性地抑制或杀死微生物的特点，

以抗生素的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效成份效力的方法。是国际上通用

的、经典的抗生素效价测定方法，在各国药典中被普遍采用。多用于结构十分复杂和

多组分的抗生素的含量测定。

抗生素微生物检定法根据试验方法的不同可分为：稀释法、比浊法、扩散法。

（1）稀释法将等量的试验菌菌液加入到含有不同浓度的抗生素的液体培养基中，

观察液体培养基中有无细菌生长，所得的结果是一种范围而不是绝对值。主要用于

MIC测定及临床药敏试验。

（2）比浊法是将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的澄清的营养丰富的液体

培养基中，混匀后，在一定的温度下，短期培养（约3～4小时），培养基变浑浊，其

浑浊程度与细菌数的增加、细菌群体质量的增加和细菌群体细胞容积的增加之间存在

直接关系，当一定光束照射培养基时，通过测定其透过率就可知道细菌生长的情况，

其吸光度与抗生素浓度关系符合比尔定律，即在一定的抗生素浓度范围内，剂量反应

为一直线。因此，在剂量反应响应曲线的直线范围内，即可设计用比浊法测定抗生素

含量。

（3）扩散法扩散法中又有纸片法、管碟法等，纸片法主要用于药敏试验，我国药

典收载的抗生素效价测定方法主要是管碟法，也是国际通用的方法。其基本原理是利

用抗生素在摊布特定试验菌的琼脂培养基内的扩散作用，形成一定浓度的含抗生素的

球型区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈，将已知效价的标准溶液和未知

效价的供试品溶液在同样条件下进行培养，比较两者抑菌圈大小，在一定的抗生素浓

度范围内，对数浓度与抑菌圈直径成正比。

根据试验设计的不同，管碟法和比浊法均可分为：一剂量法（标准曲线法，一般用

于制备标准曲线和测定血药浓度）、二剂量法（含量测定）、三剂量法（检品仲裁和

标准品标定）

一剂量法：将标准品一组剂量对微生物的反应在对数坐标上制成直线图，相同条件

下，测得供试品对微生物得反应值，在标准品的标准曲线上查出引起该反应的抗生素

的相对浓度及效力。

二剂量法：用标准品、供试品各高、低两个剂量，采用量－反应平行线原理，在相

同试验条件下，比较标准品和供试品二者对供试品产生的效力。

三剂量法：用标准品、供试品各高、中、低三个剂量，采用量－反应平行线原理，

在相同试验条件下，比较标准品和供试品溶液抑菌圈的大小，以求得供试品的效价。

剂量间的比值为0.8。

二、注意事项

在设计用管碟法和比浊法测定效价时，需注意以下几个问题：

（1）试验菌的选择：以中国药典附录规定的试验菌为首选，根据需要可选择其他

的试验菌，当最好与各国药典收载的试验菌一致，便于国际交流。1）以抗生素的作用

机理和抗菌谱为基础，显示临床特点，对抗生素主要成分有较强的敏感性，而对所含

杂质、降解物不敏感。2）试验菌为非致病菌或致病菌的无毒变株，菌落典型，特征稳

定不易变异，易于培养、保存、安全无致病性。试验菌菌落形态要典型，无杂菌，要

保持菌种的新鲜，要力致保持菌悬液中菌群的一致性。3）管碟法试验菌产生的抑菌圈

清晰、稳定、测定误差小，不产生次级圈。比浊法以球菌和短杆菌为宜。

（2）培养基的选择。培养基的原材料非常重要，管碟法的培养基中的胨、肉膏、

琼脂等，都能影响到抑菌圈的大小与清晰度，试验发现不同胨所得抑菌圈大小和清晰

度是有差别的：骨栋、鱼胨、鸡胨较好，肉胨、蛋胨较差；比浊法所用培养基应澄明，

颜色以尽量浅为佳，本身不得出现浑浊，灭菌后也不得发生沉淀。培养基的成分应能

满足细菌快速生长的需要，一般可加入牛肉浸出粉和酵母浸出粉。如在以金黄色葡萄

球菌为试验菌的试验中加入适量的牛肉浸出粉和酵母浸出粉，可使细菌生长速度过快，

达到比浊法测定的要求。另外，培养基的pH值可以影响抗生素的抗菌活性，酸性抗