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DNA重组质粒构建;基因克隆genecloning
应用酶学方法,在体外将目标基因与载体DNA结合成一含有自我复制能力DNA分子(重组体),继而经过转化或转染宿主细菌或细胞、筛选出含有目标基因转化子细菌或细胞,再进行扩增、提取取得大量同一DNA分子拷贝。
关键技术:DNA重组技术
(recombinantDNAtechnique)
;基因克隆基本程序:
分—切—接—转—筛
PCR酶切连接转化转染抗性或标识筛选
目标基因DNA片段取得
外源DNA分子与载体DNA分子体外重组
重组DNA分子转移到适当受体菌或细胞
重组DNA分子克隆筛选和判定
目标基因或其表示产物纯化和判定
基因克隆技术特点:
1.可在体外人工,有目标,依据需要进行基因重组、表示、测序、诱变、修复;
2.方法简便、快速、准确、特异,能确保研究与开发需要。;基因克隆示意图;胰岛素
人生长激素
干扰素
白细胞介素2
粒细胞集落刺激因子
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
红细胞生成素EPO
组织纤溶酶原激活剂
生长激素
促生长素
抗血友病因子Ⅷ
脱氧核糖核酸酶
葡糖脑苷脂酶
鼠单克隆抗体;例:
干扰素是治疗癌症主要物质,人血液中每升只能提取0.05μg干扰素,因而其价格昂贵。但美国有一家企业用遗传工程方法合成了价格低廉、药性一样干扰素,其详细做法是:
从人淋巴细胞中提取能指导干扰素合成基因,并使之与一个叫做质粒DNA结合,然后移植到酵母菌内,从而用酵母菌来产生干扰素。
酵母菌能用出芽方式繁殖,速度很快,所以,能在较短时间内大量生产干扰素。利用这种方法不但产量高,而且成本也较低。;DNA重组操作过程;重组质粒构建:目标DNAPCR扩增
DNA片段和载体酶切
片段DNA与载体连接
载体:plasmid(primary)
工具酶:限制性内切酶
连接酶
;常见基因工程载体;载体基本结构单元:
1.复制起点
2.克隆位点
3.筛选标识
其它条件:
4.适当大小
5.易于操作:包含宿主、转化(或转染)、分离纯化、重组等等。;质粒(Plasmid);通常质粒含有一些染色体没有基因,负责编码一些功效???白,这些功效并不是细菌生存所必需,但在一定环境下,可对细菌宿主生存有利。由质粒产生表型包含反抗生素抗性(R因子)、产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生大肠杆菌素(大肠杆菌素因子col)、肠毒素及限制酶、修饰酶等。
质粒存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中,在细菌细胞中最多。它们复制时利用宿主细胞复制本身染色体同一组酶系。
;重组质粒构建专题宣讲;质粒DNA特征;;(四)人工构建质粒基本元件;pBR322plasmid是一个克隆载体,作为一个克隆载体最基本要求都具备:
复制起点:Ori
克隆位点:EcoRI;HindIII;BamHI;SalI
筛选标识:Ampr。
;T-vectorPCR产物亚克隆载体;T—Vector是一个高效克隆PCR产物(TACloning)专用载体,由pUC18载体改建而成。在pUC18载体多克隆位点处XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点,用EcoRV进行酶切反应后,再在两侧3‘端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物3’末端添加一个“A”特征,所以用本制品可大大提升PCR产物连接、克隆效率。
T-vector克隆PCR产物时用高效连接液LigationSolutionI能够在极短时间内(30分钟~1小时)完成连接反应,大大地方便了试验操作。
用途
克隆PCR产物。
对克隆后PCR产物使用M13primers进行DNA测序。;重组质粒构建专题宣讲;原核生物表示载体
Bacterialexpressionvector;复制起点
克隆位点
筛选标识
开启子﹡
转录终止序列﹡
核糖体结和位点:起始密码子ATG和SD序列(翻译识别);重组质粒构建专题宣讲;重组质粒构建专题宣讲;真核生物表示载体
(mammalianexpressionvector);真核生物表示载体结构单元;重组质粒构建专题宣讲;LocationofFeatures
PCMVIE:
CMVIEenhancer:1-659
CMVIEpromoter:
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