生物分离工程-吸附法.pptVIP

吸附柱层析法操作法1上样和洗脱经过平衡的层析柱，当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把样品溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2(当加入的样品量相同时，体积越小越有利于提高分辨率)。待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂(其体积用液面距固定相表面的高度约5厘米计)，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始冼脱。同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。将吸附剂填装在玻璃或不锈钢管中，构成层析柱，层析时欲分离的样品自柱顶加入，当样品溶液全部流入吸附层析柱后，再加入溶剂冲洗。冲洗的过程称为洗脱，加入的溶剂称为洗脱剂。在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。即被吸附的物质被溶剂解吸而随溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒被再吸附，后面流下的溶剂又再解吸而使其下移动。经过一段时间以后，该物质会向下移动一定距离。此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物质的解吸(溶解)能力有关。不同的物质由于吸附力和解吸力不同，移动速度也不同。吸附力弱而解吸力强的物质，移动速度就较快。经过适当的时间以后，不同的物质各自形成区带，如果被分离的是有色物质的话，就可以清楚地看到色带(色层)。如果被吸附的物质没有颜色，可用适当的显色剂或紫外光观察定位，也可用溶剂将被吸附物从吸附柱洗脱出来,再用适当的显色剂或紫外光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱曲线。吸附柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱剂和操作方式。(二)洗脱涤的选择洗脱剂指的是溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂。合适的洗脱剂应符合下列条件：①纯度较高；②稳定性好；③能较完全洗脱所分离的成分；④黏度小；⑤易和所需要的成分分开。在实践中，选择洗脱剂的顺序是由极性小到极性大(正向层析)。当把极性小的洗脱剂换成极性大的时，宜先将极性大的和极性小的洗脱剂混合使用，浓度则由低到高。总之，选用洗脱剂的原则是能较完全地洗脱所要分离的成分，并力求用量少、洗脱时间短。为了获得满意的分离结果，若峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的强度，若峰间距离过大，或某些成分不能洗脱时，宜加大洗脱剂的强度(极性)，成分复杂时，可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱(方法见离子交换层析)。大网格吸附剂吸附条件选择1吸附剂的选择（相似互溶）：非极性吸附剂从极性溶剂中吸附非极性物质高极性吸附剂从非极性溶剂中吸附极性物质中等极性吸附剂对两种情况均有吸附能力孔径与比表面（孔径6倍于分子直径）吸附法提取的生化物质大多是弱极性或非极性，一般选非极性或中等极性。非极性吸附剂中等极性吸附剂中等极性吸附剂2．无机盐的影响无机盐存在，对吸附不仅无干扰，还有促进作用（盐析）。3．吸附pH弱酸物质：pHpK弱碱物质：pHpK（呈分子状态）中性物质：pH无影响（不会电离）。大网格吸附剂吸附条件选择在分子间相互作用的总能量中，各种力所占的相对比例是不同的。主要取决于分子的两个性质，即它的极性和极化度。极性越大，定向力作用越大；极化度越大，色散力的作用越大。诱导力是次级效应，范德华力中的色散力是普遍的一种力一种特殊的分子间作用力，介于库仑引力与范德华引力之间的特殊定向力，比诱导力、色散力都有大两种原子电负性越大，半径越小，H键就越能形成，作用也就越大，越有利于吸附。不同元素原子所形成的氢键力大小次序如下：F-H······FO-H······NN-H······ON-H······NNC······N氢键力吸引力和推斥力当分子间距离减小时，范德华力增大，但当分子间距离非常接近时，就明显地表现出斥力。当距离大于OB时，吸引力未表示出来。当吸附表面和分子间的距离减小时，其吸引力的能量逐渐增加，当距离减至分子半径OA时，达到最大值。当距离再减小时，推斥力急剧增加。吸附等温线如果不考虑溶剂的吸附，当固体吸附剂与溶液中的溶质达到平衡时，其吸附量m应与溶液中溶质的浓度和温度有关。吸附等温线表示平衡吸附量，并可用来推断吸附剂结构、吸附热和其他理化特性。当温度一定时，吸附量只和浓度有关，m=f(c)，这个函数关系称为吸附等温线。吸附等温线Langmuir等温线单分子层Freundlich等温线单分子层Henry等温线稀浓度等温线多分子层吸附等温线1.Langmuir等温线(单分子层)2.