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;一、概述;简史:
马文.闵斯基(MarvinMinsky)1957
〔美国专利〕
矛盾:成像质量、扫描速度
狭缝扫描:成像质量不佳
台阶扫描:光栏不动,移开工作台标本
光束扫描:现通用;二、根本原理;2.成像保存
以电信号形式储存,
可以进行图象分析〔参数、伪彩、值等〕。
3.共轭(confocal)
是指光源孔和检测针孔对物镜焦平面是共轭的。;宽场照明显微镜和共聚焦图象比较;三、CLSM的应用;;;图象处理功能
1.光学切片功能:显微CT
微动进步马达最小步距0.1um
2.三维图象重建:3D软件
X,Y,Z轴重建,立体旋转
;3.荧光物质的定位,定量与动态测量〔单标、双标、多重标记〕
;;;;高速采集;FRAP光漂白;Tubulin;Actin;;
;;;;FRAP荧光粹灭漂白恢复法举例;A;A;4、膜流动性的测定
细胞膜荧光探针受到极化光的刺激激化后,
发射光的极性依赖于荧光分子的旋转,
而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围膜流动性,
故极性测量可以反映膜的流动性;;笼锁化合物的两种光化学反响原理:
偶氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光致分解作用;;2.邻硝基甲苯衍生物:
目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯的光敏性质合成。
当生物活性分子与硝基甲苯结合即暂时失活,故又将后者称为掩蔽基团或笼锁基团。
一旦受到光照,连接于侧链碳原子的前体即解离而释放出活性分子、质子和亚硝基副产物。;笼锁神经递质、调质及抗体
例:光照解笼锁
NPE-氨甲酰胆碱→血管平滑肌收缩〔氨甲酰释放〕
Caged入Cell途径:诱入法,酯化法,电极导入法,膜片钳全细胞方式导入法;CLSM的优点;四、CLSM使用步骤;〔二〕??选择荧光探针
1000余种
钙:Fluo-3/am(水溶性)不用紫外光激发,可渗透细胞。Fluo-2用紫外激发,不穿透,需用Microinjection
观察细胞内PH:Snarf荧光素中插入萘而合成,可与Fluo-3或Fluo-2联合测定细胞内钙与PH;CLSM常用荧光探针;;;Livingdye-GreenFluorescenceprotein(GFP);绿色荧光蛋白GFP分子结构图;当GFP受紫外光或蓝光激发时,α-螺旋包含的发色团会发出绿色荧光。
由于这一特点及其无种属限制,GFP作为荧光标签被广泛用于细胞水平上的监测生物活动??;在GFP基因上突变几个不同的位点形成增强型绿色荧光蛋白(enhancedGFP,EGFP),黄色〔EYFP〕,黄绿色〔ECFP〕和兰色〔EBFP〕的活体荧光蛋白。
这些荧光蛋白都具有稳定、无细胞毒性、灵敏度高,不需反响基质〔substrate〕等优点,又称为单标记系统〔singletagsystem〕。;TheDiscoveryofAequorinandGFP;;;转染pEGFP载体后24h可见神经干细胞集落内有少量GFP阳性细胞。
(荧光+普通光相差显微镜×100倍);加血清48h后,神经干细胞集落内和周边均有GFP阳性细胞。
(荧光+普通光相差显微镜,荧光相差显微镜×400倍);;;;最重要是能用于活细胞和蛋白质进行实时定位和观察,不需特殊的激发光谱,故又将此组荧光蛋白称为自动荧光蛋白(autofluorescentproteins,AFPs)。
红色荧光蛋白(RFP)是从海产的IndoPacificseaanemonerelativeDiscomaStriiata中别离的一种独特的显示红色荧光的蛋白质,故又名为DsRed。;1.神经细胞参数测定及三维重建
细胞外形
浦肯野氏细胞及其突起的投射
神经细胞轴突走向及神经支配的研究
神经骨架重组的研究;2.神经递质、调质及细胞内活性物质受体的荧光定位
3.细胞内钙离子的测定
细胞内信号传导的研究
钙内流与神经递质释放的关系
微环境变化,受体激活,电刺激与钙的释放
4.细胞内PH值的测定,脑缺血,损伤时细胞内PH变化;;划痕负载法计算公式;;Thanksforyourattention!
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